威尼德分子雜交儀：Western試驗(yàn)問題歸納與總結(jié)

 Q1: PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？

A1:一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，若反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來，效果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（注：常用的PVDF膜即帶正電荷的尼龍膜），同時(shí)也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，效果較好。

    Q2:做組織樣品的western blot的時(shí)候，處理樣品有什么訣竅？

A2: 必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋白酶抑制劑），封閉劑一般5%脫脂奶粉。如果一抗為多克隆抗體，使用BSA也是不錯(cuò)的選擇

    Q3:免疫組化和Western blot可以用同一種抗體嗎？

A3: 免疫組化時(shí)抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western blotting，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間。（限于單抗）

    Q4: 不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？

A4: 可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》)，因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6％。太大時(shí)還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時(shí)間。

    Q5:Western blot哪種染色好？

A5: (1）陰離子染料是常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達(dá)到 1.5μg，考馬斯亮藍(lán)雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質(zhì)中除去，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會(huì)引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞，不能用于帶正電荷的膜。靈敏度低。

(2）膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到pg級，但染色比較穩(wěn)定。

（3）生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。

    Q6: 用Western檢測基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)的目的蛋白（定性），分子量為20KD，濃度約為幾百ng/ml。蛋白樣品是否需濃縮、純化？如何濃縮、純化上清液中的目的蛋白？對小分子蛋白Western blot時(shí)需特別注意哪些條件？

A6：按照提供的濃度，如果做Western blot，是不用濃縮樣品的. 對于20kd的小分子的蛋白，Western Blot中要注意的是：

    1、轉(zhuǎn)移時(shí)的時(shí)間，

    2、轉(zhuǎn)移時(shí)的電流或電壓.

    3、transfer buffer 中加20%的甲醇.

    4、可以用13-15%的分離膠.

    Q7: 半干法轉(zhuǎn)移與膠的面積和蛋白分子兩大小有一定關(guān)系，那么濕法轉(zhuǎn)移是不是所有的轉(zhuǎn)移條件都一樣呢？一般的條件是怎樣的？

A7：半干轉(zhuǎn)的電流大小是按照面積來算的，時(shí)間是根據(jù)蛋白分子大小定的；而濕轉(zhuǎn)的話電流是恒定的，時(shí)間也是根據(jù)分子量而定。

    Q8: 采用生物素標(biāo)記的二抗-SABC-DAB檢測系統(tǒng)做western，非特異性的條帶和背景很高，總蛋白考染的時(shí)候發(fā)現(xiàn)接近積層膠的條帶比較清楚，條帶也很窄，可是越靠下面的條帶越來越寬，有的跑得都連在一起，這是什么原因，如何解決？SDS—PAGE的時(shí)候恒壓和恒流哪個(gè)好？

A8：非特異性的條帶和背景高：可能性很多，如一抗，二抗，封閉的原因都可能。總蛋白考染的時(shí)候發(fā)現(xiàn)接近積層膠的條帶比較清楚，條帶也很窄，可是越靠下面的條帶越來越寬，有的跑得都連在一起，這種現(xiàn)象是正常的。另外，也可能積層膠有問題。SDS—PAGE的時(shí)候，恒壓和恒流都可以用。

    Q9: 血清樣品進(jìn)行Western blot 分析，目的蛋白21kD，結(jié)果顯色出來后，目的條帶很淡，而白蛋白和IgG條帶很濃，為什么？

A9：可能是因?yàn)榘椎鞍诪?/span>67kD和目的蛋白相差較大，且其濃度較低，可以底物二氨基聯(lián)苯胺和0.01%過氧化氫溶液顯色的時(shí)間延長為30分鐘，再用去離子水漂洗以終止反應(yīng)；也可能是抗體的特異性不好。把封閉的時(shí)間延長，同時(shí)提高封閉液的濃度，可以減少以下背景噪音。同時(shí)洗的時(shí)候要*，而目的條帶弱，說明濃度不足，如果不考慮后續(xù)功能的話，可過G-50（細(xì)）柱子，純化靶蛋白，接著真空冷凍濃縮，可以得到很好的結(jié)果。

    Q10: Western轉(zhuǎn)膜已經(jīng)成功了，但是Marker泳道未見蛋白條帶，其余各泳道均有清晰的蛋白條帶，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染膠，結(jié)果相同。經(jīng)5%的脫脂牛奶封閉1小時(shí)45分鐘后，進(jìn)行一抗孵育（1：200，建議起始濃度）過夜，二抗孵育5個(gè)半小時(shí)（1:2000），均在室溫下，DAB顯色，雖出現(xiàn)蛋白條帶，但較弱，且出現(xiàn)非特異性條帶。所用Marker可分離14-116KD的蛋白，是否因?yàn)?/span>marker有問題？一抗（多克隆抗體）、二抗的濃度及孵育的時(shí)間是否合適？封閉的時(shí)間是否太短？

A10：1. marker有可能被降解，也有可能是上樣量太少。

     2. 建議一抗4℃孵育過夜，稀釋比為1:100；如室溫孵育，兩小時(shí)即可。

     3. 二抗室溫1小時(shí)，1:2000，或 4℃封閉過夜（室溫兩小時(shí)就夠），一抗室溫1小時(shí)，二抗室溫1小時(shí)，最好是一抗4℃過夜（或室溫2小時(shí)）1:200，二抗室溫1小時(shí)1:2000，換ECL法。