威尼德核酸分子雜交試驗問題歸納與總結(jié)

常見問題

Q1：標記方法有哪幾種？

A1：（1）切口平移法（2）隨機引物法（3）末端標記法（4）單鏈DNA探針標記（5）寡核苷酸探針標記法
Q2：探針標記物的分類有幾種？

A2：（1）探針標記物有放射性核素與非放射性物質(zhì)兩種。放射性核素標記敏感性高，可檢測pg水平的核酸，但因不易長期保存，且存在放射性污染等問題，現(xiàn)已較少應用。

（2）非放射性物質(zhì)常用的有生物素、地高X等，非放射性探針安全、穩(wěn)定、操作方便并且經(jīng)濟，但敏感性較低，近年來，由于雜交信號檢測方法的改進，檢測的敏感性得到了很大提高。

Q3：怎樣確定探針的濃度？

A3：總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。要獲得較滿意的敏感性，膜核酸分子雜交中放射性核素標記探針與非放射性標記探針的用量分別為5-10 ng/ml和25-1000 ng/ml，而原位雜交中，無論應用何種標記探針，其用量均為0.5-5.0 μg/ml。

Q4：如何選擇核酸分子雜交的最適溫度？

A4：核酸分子雜交技術(shù)最重要的因素之一是選擇最適的核酸分子雜交反應溫度。若反應溫度低于Tm 10-15 ℃，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少。若反應溫度再低（Tm-30 ℃），雖然互補鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實驗前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗，即最適復性溫度、苛刻復性溫度及非苛刻復性溫度。最適復性溫度：Tor =Tm–25 ℃苛刻復性溫度：Ts = Tm – (10或15 ℃)非苛刻復性溫度：Tns =Tm – (30或35 ℃)

 Q5：核酸雜交篩選寡核苷酸探針遵循哪些原則？

 A5：（1）長18-50 nt，較長探針雜交時間較長，合成量低；較短探針特異性會差些。

　   （2）堿基成分：G+C含量為40%-60%，超出此范圍則會增加非特異核酸雜交。

　  （3）探針分子內(nèi)不應存在互補區(qū)，否則會出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾"狀結(jié)構(gòu)。

　 （4）避免單一堿基的重復出現(xiàn)（不能多于4個），如-CCCCC-。

（5）一旦選定某一序列符合上述標準，最好將序列與核酸庫中核酸序列比較，探針序列應與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過70%或有連續(xù)8個或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。

Q6：合成的寡核苷酸探針具有哪些優(yōu)點？

A6：（1）由于鏈短，其序列復雜度低，分子量小，所以和等量靶位點*雜交的時間比克隆探針短，如20 nt的寡核苷酸探針在濃度為100 ng/ml，靶序列為1-100 pg、1 kb片段時，達到核酸分子雜交只需10 min，而用2 kb的克隆探針在同樣條件下達到*核酸分子雜交則需16 h。

（2）寡核苷酸探針可識別靶序列內(nèi)1個堿基的變化，因為短探針中堿基的錯配能大幅度地降低雜交體的Tm值。

（3）一次可大量合成寡核苷酸探針（1-10 mg），使得這種探針價格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學或化學方法修飾以進行非放射性標記物的標記。盡管克隆探針較特異，但通過細心篩選序列或選擇相對長的序列（＞30 nt）也可設計出非常特異的寡核苷酸探針。常用的寡核苷酸探針有18-40個堿基，目前的合成儀可有效地合成至少50個堿基的探針。