脂質體法與電穿孔法轉染哺乳動物細胞探究

一、引言

1. 基因轉染于現(xiàn)代生物學研究意義重大，是實現(xiàn)外源基因導入細胞、探究基因功能及調控機制的關鍵技術。在哺乳動物細胞研究里，合適轉染方法關乎實驗成敗。脂質體法與電穿孔法因具相對高效性備受矚目，但各有優(yōu)劣，學界持續(xù)探尋其優(yōu)化應用，為本研究提供探索空間。

2. 脂質體法借脂質體包裹 DNA 等核酸物質，經膜融合或內吞入細胞；電穿孔法則利用電脈沖瞬間穿孔細胞膜，促核酸進入。過往研究對二者機制闡述漸豐，但在不同細胞系、基因類型下精準轉染參數(shù)及適用性仍存模糊。

二、材料與方法

2.1 實驗材料

1. 細胞系：選用常見的 HEK293、HeLa 及 CHO 細胞系，分別代表腎上皮、宮頸癌細胞及中國倉鼠卵巢細胞，源于 ATCC 保藏中心，培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清、1% 雙抗的 DMEM 高糖培養(yǎng)基，37°C、5% CO?孵育箱維持生長，定期傳代確保活性。

2. 主要試劑：脂質體轉染試劑選 Lipofectamine 2000，依說明書儲存；電穿孔緩沖液為自制蔗糖溶液（272 mM 蔗糖、7 mM 磷酸鈉、1 mM MgCl?，pH 7.4）；報告基因質粒 pEGFP-N1（含 GFP 編碼序列）用于直觀監(jiān)測轉染效率，經測序驗證無誤，大提后 -20°C 保存。

2.2 實驗儀器

1. 電穿孔儀：選用 Bio-Rad Gene Pulser Xcell，可精準調控電脈沖參數(shù)，電壓范圍 100 - 2500 V，電容 25 - 3275 μF，電阻 20 - 4000 Ω，配備 0.4 cm 電擊杯，實驗前經校準確保脈沖輸出穩(wěn)定。

2. 熒光顯微鏡：Nikon Eclipse Ti2，具高分辨率 CCD 相機，激發(fā)光波長適配 GFP 檢測（488 nm），能精確捕捉細胞熒光信號，用于轉染后細胞 GFP 表達成像；流式細胞儀 BD FACSCanto II，可定量分析 GFP 陽性細胞比例，激光激發(fā)光源及熒光檢測通道優(yōu)化，保證檢測靈敏度與準確性。

2.3 實驗方法

2.3.1 脂質體法轉染

1. 細胞接種：轉染前 24 h，胰酶消化對數(shù)生長期細胞，計數(shù)后按 5×10?個 / 孔接種于 24 孔板，每孔含 500 μL 新鮮培養(yǎng)基，保證細胞貼壁均勻、生長狀態(tài)良好，置孵育箱過夜平衡。

2. 轉染復合物制備：取兩支無菌離心管，A 管加 50 μL Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基，稀釋 1 μg 質粒 DNA，輕柔混勻；B 管加 50 μL Opti-MEM，加入適量 Lipofectamine 2000（依說明書按 DNA 量對應比例），輕彈管壁混合，室溫孵育 5 min；后將 A 管 DNA 液緩慢滴入 B 管，邊滴加邊輕搖，室溫靜置 20 min 形成復合物。

3. 轉染操作：棄去孔內舊培養(yǎng)基，用 PBS 輕柔漂洗 2 次，每孔加入 200 μL 含轉染復合物的 Opti-MEM，輕晃混勻，放回孵育箱，37°C、5% CO?孵育 4 - 6 h 后換為含血清完整培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，適時鏡檢觀察細胞形態(tài)及熒光情況。

2.3.2 電穿孔法轉染

1. 細胞預處理：胰酶消化收集細胞，用預冷電穿孔緩沖液洗滌 2 次，重懸調整細胞密度至 1×10?個 /mL，冰上孵育 10 min 使細胞適應低溫低滲環(huán)境，維持細胞膜穩(wěn)定性利于穿孔。

2. 電穿孔參數(shù)設定：針對不同細胞系預實驗優(yōu)化，HEK293 細胞設電壓 250 V、電容 950 μF、脈沖時長 5 ms；HeLa 細胞 220 V、1000 μF、5 ms；CHO 細胞 300 V、800 μF、4 ms。將 200 μL 含 1 μg 質粒的細胞懸液加入電擊杯，冰浴放置，避免溫度波動影響穿孔效果。

3. 電穿孔操作：將電擊杯置于電穿孔儀電極間，觸發(fā)電脈沖，瞬間電擊后立即取出，室溫靜置 10 min，使細胞膜修復穿孔，后將細胞懸液轉至含 800 μL 預熱完整培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，輕柔混勻，37°C、5% CO?孵育，后續(xù)同樣鏡檢及檢測。

2.3.3 轉染效率及細胞毒性檢測

1. 轉染效率：轉染 48 h 后，熒光顯微鏡下隨機選取 5 個視野拍照，計數(shù) GFP 陽性細胞（發(fā)綠色熒光）與總細胞數(shù)，計算轉染效率（轉染效率 = GFP 陽性細胞數(shù) / 總細胞數(shù) ×100%）；同時用流式細胞儀定量檢測，收集細胞經 PBS 洗滌、固定后上機，以未轉染細胞設門排除自發(fā)熒光干擾，精確統(tǒng)計 GFP 陽性率，二者結合確保數(shù)據可靠。

2. 細胞毒性：采用 MTT 法，轉染 24 h、48 h 分別向孔內加 20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），37°C 孵育 4 h，棄上清加 DMSO 溶解結晶，酶標儀測 570 nm 吸光度，以未轉染細胞吸光度為對照（細胞存活率 = 實驗組吸光度 / 對照組吸光度 ×100%），直觀反映細胞活性變化，評估轉染對細胞生存影響。

三、結果

3.1 不同細胞系轉染效率對比

1. 熒光顯微鏡觀察：在 HEK293 細胞中，脂質體法轉染 48 h 后視野內可見較多明亮綠色熒光細胞，分布相對均勻，轉染效率初步估計約 60%；電穿孔法下熒光細胞亮度更高，轉染效率超 70%。HeLa 細胞脂質體轉染效率約 50%，電穿孔法達 65% 左右，部分細胞呈團塊狀高表達 GFP。CHO 細胞脂質體轉染效率偏低，約 40%，電穿孔法則超 55%，但細胞膜完整性受影響跡象略明顯，少數(shù)細胞有破裂、皺縮表現(xiàn)。

2. 流式細胞術定量：經流式精確分析，HEK293 細胞脂質體法轉染效率均值 63.5%，電穿孔法 72.8%；HeLa 細胞對應為 52.2%、66.7%；CHO 細胞 41.3%、57.5%，與顯微鏡觀察趨勢高度契合，凸顯電穿孔法整體轉染效率優(yōu)勢，尤其在 HEK293 細胞表現(xiàn)突出，脂質體法在 HeLa 及 CHO 細胞尚有提升空間。

3.2 細胞毒性評估

1. MTT 檢測結果：轉染 24 h，HEK293 細胞脂質體法存活率 85%，電穿孔法 80%；HeLa 細胞對應為 82%、75%；CHO 細胞 78%、70%。48 h 時，HEK293 脂質體法存活率降至 78%，電穿孔法 70%；HeLa 細胞 72%、65%；CHO 細胞 68%、58%。數(shù)據表明兩種方法隨時間延長均致細胞活力下降，電穿孔法細胞毒性上升稍快，CHO 細胞對電穿孔耐受性相對較弱，脂質體法在各細胞系前期細胞毒性稍低，但后期降幅不可忽視。

四、討論

1. 轉染效率差異根源：電穿孔法高效源于強電場瞬間破膜，形成可逆微孔利于核酸快速擴散入胞質，對大質粒或難轉染基因優(yōu)勢顯著；脂質體法依賴脂質與細胞膜融合及內吞，過程復雜易受限，如細胞膜脂筏分布、內吞體逃逸效率影響核酸入核整合，致部分細胞系轉染不佳，尤其膜結構特殊或內吞機制不活躍的 CHO 細胞。

2. 細胞毒性機制：電穿孔直接破壞細胞膜完整性，雖有修復但引發(fā)離子失衡、膜蛋白損傷，激活凋亡通路；脂質體因脂質成分、復合物大小及細胞內代謝干擾線粒體功能、誘導活性氧生成，長期孵育積累毒性，在代謝旺盛的 HeLa 細胞更明顯，故需權衡轉染時長與效率，依實驗需求選適宜方法。

五、結論