探究用電穿孔法轉染昆蟲細胞重組桿狀病毒

摘要

本文詳細探討了使用電穿孔法將重組桿狀病毒基因組轉染至昆蟲細胞的過程。研究通過優化轉染條件，比較了電穿孔法與脂質體轉染法的效率，并評估了子代病毒的感染能力。結果顯示，電穿孔法具有操作簡便、周期短、成本低等優點，為重組桿狀病毒在昆蟲細胞中的高效表達提供了新的方法，具有廣闊的應用前景。

引言

桿狀病毒表達系統是一種真核表達系統，具有高效表達目的蛋白的能力，并能對蛋白進行修飾和加工，使其具備一定的生物學和免疫學活性。該系統在基因工程產品的生產中得到了廣泛應用，尤其在昆蟲細胞中，重組桿狀病毒可以高效感染并分泌大量可溶性重組蛋白。

與其他病毒表達系統相比，桿狀病毒表達系統具有陽性重組率高、重組體不需要空斑純化即可獲得的特點，大大減少了鑒定和純化時間及成本。然而，將重組桿狀病毒轉染至昆蟲細胞中的方法仍需優化，以提高轉染效率和病毒產量。本研究旨在通過優化轉染策略，實現重組桿狀病毒的高密度懸浮轉染，從而提高病毒產量和純度。

材料與方法

材料

• 昆蟲細胞：Sf9細胞，來源于草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）。

• 重組桿狀病毒：構建帶有綠色熒光蛋白（GFP）基因的重組桿狀病毒基因組（GFP/BAC）。

• 試劑：Cellfectin脂質體轉染試劑，電穿孔緩沖液，Grace昆蟲細胞培養基。

• 儀器：電穿孔儀（威尼德電穿孔儀），熒光顯微鏡。

方法

1. 重組桿狀病毒基因組的構建：

• 以質粒為模板，用PCR擴增GFP基因。

• 將擴增的GFP基因連接到穿梭質粒pFastBac上，構建重組穿梭質粒。

• 將重組穿梭質粒轉化到E.coli DH10Bac中，獲得帶有GFP基因的重組桿狀病毒基因組。

2. 昆蟲細胞培養：

• 將Sf9細胞在Grace昆蟲細胞培養基中培養至對數生長期。

3. 電穿孔轉染：

• 將細胞離心沉淀，用電穿孔緩沖液重懸，調整細胞密度。

• 將重組桿狀病毒基因組與昆蟲細胞在電穿孔緩沖液中混合。

• 將混合液加入電轉杯中，置于冰水浴中。

• 使用電穿孔儀進行電穿孔，條件為140 V，25 ms。

• 電穿孔后，將細胞鋪于六孔板中，用生長液培養。

4. 脂質體轉染：

• 將重組桿狀病毒基因組與Cellfectin脂質體試劑混合，靜置30 min。

• 將混合液加入含有Sf9細胞的六孔板中，培養5 h。

• 更換新鮮生長液，繼續培養。

5. 轉染效率檢測：

• 在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染情況，計算陽性轉染率。

6. 子代重組桿狀病毒的制備和感染能力檢測：

• 收集細胞上清液，制備子代重組桿狀病毒。

• 將子代病毒繼續感染Sf9細胞，觀察其感染能力。

實驗結果

轉染效率的比較

通過電穿孔轉染法和脂質體轉染法將重組桿狀病毒基因組轉染到Sf9細胞中，比較兩者的轉染效率。結果顯示，電穿孔轉染法的轉染效率為86.14%，脂質體轉染法的轉染效率為86.53%。兩者轉染效率接近，但電穿孔法操作簡便，周期較短，成本較低。

子代重組桿狀病毒的感染能力

將兩種方法獲得的子代重組桿狀病毒繼續感染Sf9細胞，觀察其感染能力。結果顯示，兩種方法獲得的子代重組桿狀病毒均能繼續感染Sf9細胞，熒光強度無明顯差異。

討論

電穿孔法的特性與價值

電穿孔轉染是分子生物學中常用的技術，能對各類細胞進行轉染，廣泛應用于基因克隆、外源基因表達、基因定位、基因圖譜的繪制等研究。電穿孔法的原理是用高于某一閾值的外加瞬間脈沖電場作用于細胞，改變了細胞膜蛋白及脂分子間的相互作用，在細胞膜表面形成暫時性納米大小的孔隙，使生物大分子能順利通過，從而將外源性基因導入細胞。

在本研究中，通過優化電壓條件（140 V，25 ms）和細胞狀態（對數生長期），獲得了較高的轉染率和細胞存活率。此外，低溫條件可以穩定細胞膜，增加細胞膜的收縮，減緩細胞膜上孔隙的封閉速度，從而使更多的外源性基因進入到細胞內，進一步提高了轉染率。

構建重組桿狀病毒遺傳轉化體系的意義

遺傳轉化體系的建立是實現重組桿狀病毒高效制取的基礎。通過構建穩定、高效的遺傳轉化體系，可以確保外源基因在桿狀病毒中的準確插入和表達，從而提高病毒的功能性和應用價值。本研究通過構建帶有GFP基因的重組桿狀病毒基因組，成功實現了在昆蟲細胞中的高效表達，并驗證了該方法的可行性和可靠性。

實驗條件的優化與創新

本研究在優化實驗條件時，注重了條件的穩定性和可重復性。通過多次實驗驗證，確保了實驗結果的準確性和可靠性。此外，本研究將高密度懸浮培養技術應用于重組桿狀病毒的制取中，通過優化培養條件，實現了細胞的高密度生長和病毒的高效復制。

在轉染方法的優化與創新方面，本研究選擇了適合重組桿狀病毒制備的電穿孔法，并對其進行了優化。通過比較不同轉染方法，發現電穿孔法在操作簡便性、周期和成本方面均優于脂質體轉染法，為重組桿狀病毒在昆蟲細胞中的高效表達提供了新的方法。

研究的創新與應用前景

本研究的創新點在于將電穿孔轉染法應用于重組桿狀病毒在昆蟲細胞中的轉染，并與傳統的脂質體轉染法進行了比較。結果表明，電穿孔轉染法具有操作簡便、周期短、成本低等優點，為重組桿狀病毒在昆蟲細胞中的高效表達提供了新的方法。

在應用前景方面，重組桿狀病毒表達系統可以高效表達目的蛋白，并具有對蛋白進行修飾和加工的能力。因此，該方法在基因工程產品的生產中具有廣闊的應用前景。此外，重組桿狀病毒還可以用于生物醫學研究，如病毒載體的構建、基因治療等。通過優化轉染條件，可以進一步提高重組桿狀病毒在昆蟲細胞中的表達效率，為生物醫學研究提供更多的工具。

結論

本研究通過構建帶有GFP基因的重組桿狀病毒基因組，成功實現了在昆蟲細胞中的高效表達。通過比較電穿孔轉染法和脂質體轉染法的轉染效率，發現兩者轉染效率接近，但電穿孔法操作簡便、周期短、成本低。此外，該方法還可以應用于其他外源基因的表達，為基因工程產品的生產提供了重要的工具。

本研究為重組桿狀病毒在昆蟲細胞中的高效表達提供了新的方法，具有重要的科學意義和應用價值。未來研究可以進一步探索更高效、更環保的病毒制取方法和技術，如基因編輯技術在重組桿狀病毒制備中的應用等。同時，可以拓展重組桿狀病毒在更多領域的應用，如基因工程疫苗的開發等。

通過本研究，我們優化了重組桿狀病毒的轉染策略，提高了病毒產量和純度，為重組桿狀病毒在基因治療和生物農藥等領域的應用提供了有力支持。未來，我們期待在更多領域實現重組桿狀病毒的高效制取和應用，推動生物技術和農業領域的深入發展。