借助磷酸鈣鹽沉淀法搭建雙質粒轉染細胞模型

摘要：本研究旨在利用磷酸鈣鹽沉淀法建立穩定的雙質粒轉染細胞模型，以探索血管緊張素II受體1型（AT1）和鈣/鈣調蛋白依賴性激酶II（CaMKII）的相互作用。通過該方法，成功將AT1和CaMKII/WT或CaMKII/DN質粒轉入COS7細胞，并觀察到其在細胞內的表達及功能。該方法為進一步研究AT1和CaMKII的相互作用提供了可靠的平臺。

引言

磷酸鈣鹽沉淀法作為一種經典的質粒轉染方法，因其操作簡便、成本低廉而被廣泛應用于基因轉染實驗中。該方法通過將質粒DNA與磷酸鹽緩沖液混合，并加入氯化鈣溶液形成磷酸鈣-DNA復合物，這些復合物能夠黏附到細胞膜并通過胞飲作用進入細胞，從而實現基因轉染。雙質粒轉染細胞模型的建立對于研究多個基因間的相互作用具有重要意義。本研究旨在利用磷酸鈣鹽沉淀法搭建表達AT1和CaMKII的雙質粒轉染COS7細胞模型，以觀察其在細胞內的表達及功能，為進一步研究其相互作用提供基礎。

材料與方法

1. 材料

• 細胞株：COS7細胞株，購自日本千葉大學。

• 質粒：帶HA-tag的AT1質粒（WT，小鼠來源）、帶V5-tag的CaMKII質粒（δB/WT或無功能活性抑制體DN型，小鼠來源），由本實驗室構建、純化和篩選。

• 試劑：磷酸鈣鹽沉淀法轉染試劑；EcoRI、NotI、BamHI內切酶；兔抗人CaMKII、山羊抗人AT1、兔抗HA、小鼠抗V5抗體；GAPDH、HRP標記二抗、熒光二抗；瓊脂糖；DMEM培養基（低糖型）、胎牛血清（FBS）；ECL顯影劑；質粒抽提試劑盒；膜蛋白抽提試劑盒；Western和IP細胞裂解液。

• 儀器：瓊脂糖凝膠電泳儀、瓊脂糖凝膠成像儀；聚丙烯酰胺凝膠電泳及半干法電轉儀、聚丙烯酰胺凝膠成像儀；CO2培養箱、細胞培養平板、微量移液器等。

2. 方法

2.1 質粒擴增、篩選及抽提

利用大腸桿菌JM109進行質粒擴增，通過篩選和抽提獲得高純度質粒DNA。質粒DNA的濃度和純度通過分光光度計檢測，確保無蛋白和RNA污染。

2.2 細胞培養

COS7細胞在含有10% FBS的DMEM培養基中培養，置于37℃、5% CO2的加濕培養箱中。細胞以適當的密度接種至培養皿或培養板中，待細胞貼壁生長至約70%-80%匯合度時進行轉染。

2.3 磷酸鈣鹽沉淀法轉染

1. 在無菌的離心管中，將適量的AT1和CaMKII/WT或CaMKII/DN質粒DNA與等體積的2 M CaCl2溶液混合。

2. 緩慢地將DNA-CaCl2混合液滴加到含有2×HBS緩沖液的離心管中，同時輕輕吹打，使DNA與磷酸鈣形成微小的復合物。

3. 室溫靜置20-30分鐘，讓磷酸鈣-DNA復合物逐漸形成。

4. 將制備好的磷酸鈣-DNA復合物逐滴均勻地加入到細胞培養皿或培養板中，輕輕晃動使復合物均勻分布。

5. 將細胞置于37℃、5% CO2的培養箱中培養6-8小時，然后更換新鮮培養基。

2.4 檢測轉染效果

轉染后24-48小時，收集細胞進行基因活性的檢測。采用免疫熒光法（IF）和免疫印跡法（WB）測定細胞表面表達的AT1（及其所帶的HA-tag）、細胞質內表達的CaMKII/WT或CaMKII/DN（及其所帶的V5-tag）。給予轉染細胞以血管緊張素II（AngII）、AT1受體拮抗劑（ARB）+AngII等刺激，通過WB測定磷酸化細胞外調節蛋白激酶（p-ERK）的改變。

結果

1. 質粒酶切及電泳鑒定

質粒DNA經過EcoRI和NotI雙酶切后，通過瓊脂糖電泳鑒定目的DNA片段。電泳結果顯示，酶切后的質粒DNA呈現出預期的長度，表明質粒構建成功。

2. 轉染效果檢測

2.1 免疫熒光法（IF）

轉染后的COS7細胞通過IF檢測AT1和CaMKII的表達。結果顯示，轉染AT1和CaMKII/WT或CaMKII/DN質粒的細胞呈現出明顯的陽性熒光反應，而未轉染的細胞則無熒光信號。這表明AT1和CaMKII成功表達在COS7細胞表面和細胞質內。

2.2 免疫印跡法（WB）

通過WB檢測轉染細胞中AT1和CaMKII的蛋白表達水平。結果顯示，轉染AT1和CaMKII/WT質粒的細胞在預期位置出現特異性條帶，而未轉染的細胞則無相應條帶。此外，給予AngII刺激后，轉染AT1和CaMKII/WT的細胞產生p-ERK升高反應，這種反應可被ARB預處理消除；而未轉染細胞及轉染AT1和CaMKII/DN的細胞無類似反應。這表明AT1和CaMKII在COS7細胞中成功表達并具有相關功能。

討論

1. 磷酸鈣鹽沉淀法的優勢與局限性

磷酸鈣鹽沉淀法作為一種經典的基因轉染方法，具有操作簡便、成本低廉的優勢。該方法適用于大多數類型的細胞，尤其對于貼壁細胞轉染是常用并的方法。然而，磷酸鈣鹽沉淀法的轉染效率相對較低，且容易受到實驗條件的影響，如pH值的微小變化都可能導致轉染效率的波動。此外，該方法還存在一定的細胞毒性，可能影響實驗結果的準確性。因此，在實驗中需要嚴格控制實驗條件，以確保轉染效果。

2. 雙質粒轉染細胞模型的意義

雙質粒轉染細胞模型的建立對于研究多個基因間的相互作用具有重要意義。本研究成功利用磷酸鈣鹽沉淀法將AT1和CaMKII/WT或CaMKII/DN質粒轉入COS7細胞，并觀察到其在細胞內的表達及功能。這一模型的建立為進一步研究AT1和CaMKII的相互作用提供了可靠的平臺。通過該模型，可以深入探究AT1和CaMKII在細胞信號傳導途徑中的相互作用機制，為相關疾病的治療提供新的思路和方法。

3. 實驗策略與創新

本研究在實驗策略上采用了磷酸鈣鹽沉淀法進行雙質粒轉染，并利用IF和WB等方法對轉染效果進行檢測。這一策略不僅操作簡便、成本低廉，而且具有較高的可靠性和準確性。在實驗創新方面，本研究成功建立了表達AT1和CaMKII的雙質粒轉染COS7細胞模型，為后續研究提供了重要的實驗基礎。此外，本研究還通過給予AngII和ARB等刺激，觀察了轉染細胞對刺激的響應情況，進一步驗證了模型的可靠性。

4. 應用前景

本研究建立的雙質粒轉染細胞模型在相關領域具有廣泛的應用前景。首先，該模型可用于深入研究AT1和CaMKII在細胞信號傳導途徑中的相互作用機制，為相關疾病的治療提供新的思路和方法。其次，該模型還可用于篩選和評估針對AT1和CaMKII的藥物作用效果，為新藥研發提供重要的實驗依據。此外，該模型還可用于其他相關基因的研究，為生命科學領域的研究提供新的平臺和工具。

結論

本研究成功利用磷酸鈣鹽沉淀法建立了表達AT1和CaMKII的雙質粒轉染COS7細胞模型，并觀察到其在細胞內的表達及功能。這一模型的建立為進一步研究AT1和CaMKII的相互作用提供了可靠的平臺。通過該模型，可以深入探究AT1和CaMKII在細胞信號傳導途徑中的相互作用機制，為相關疾病的治療提供新的思路和方法。本研究不僅在實驗策略上具有創新性，而且在相關領域具有廣泛的應用前景。未來，我們將繼續利用該模型進行深入研究，以期取得更多的研究成果。