運用高效化學轉化重組法構建重組腺病毒的研究

摘要

本文采用高效化學轉化重組法成功構建了重組腺病毒，詳細描述了實驗材料、方法以及結果。通過對構建體系的優化，提高了陽性重組率，為抗腫瘤生物治療制劑的制備奠定了堅實基礎。該法具有成本低、效率高、操作簡便等優勢，具有廣闊的應用前景。

引言

重組腺病毒作為基因治療的重要載體，因其宿主細胞范圍廣、轉移效率高、滴度高及表達水平高等特點，廣泛應用于腫瘤基因治療、基因功能研究及疫苗開發等領域。然而，傳統的重組腺病毒構建方法步驟繁瑣、成本高且陽性重組率低，限制了其廣泛應用。因此，優化重組腺病毒的構建方法，提高構建效率及陽性重組率，對于推進基因治療研究具有重要意義。本研究采用高效化學轉化重組法，旨在簡化構建流程，提高構建效率，為制備具有更高抗腫瘤療效的生物治療制劑奠定基礎。

材料與方法

1. 材料

• 質粒：穿梭質粒pAdTrack-CMV、腺病毒骨架質粒pAdEasy-1、攜帶目的基因的質粒（如p21基因質粒、pcDNA3.0-survivin）。

• 菌株：大腸桿菌DH5α、BJ5183（含腺病毒骨架質粒）。

• 細胞：人胚腎293細胞。

• 試劑：某試劑PmeⅠ、PacⅠ內切酶，某試劑酚:氯仿，某試劑乙醇，某試劑脂質體LipofectamineTM2000，某試劑DNA聚合酶，某試劑PCR純化試劑盒，某試劑凝膠回收試劑盒，某試劑低熔點瓊脂糖，某試劑總蛋白裂解酶，某試劑蛋白酶抑制劑，某試劑β-半乳糖苷酶檢測試劑盒，某試劑T4 DNA連接酶。

• 儀器：某品牌PCR儀，某品牌電泳儀，某品牌離心機，某品牌超凈工作臺，某品牌倒置顯微鏡，某品牌超速離心機，某品牌超濾管，某品牌實時熒光定量PCR儀。

2. 方法

2.1 構建重組腺病毒轉移質粒

1. PCR擴增目的基因：以攜帶目的基因的質粒為模板，通過PCR擴增獲得目的基因全長序列。在5'端和3'端PCR引物中分別引入特定的酶切位點。

2. 酶切與連接：將PCR產物及穿梭質粒分別進行雙酶切，回收目的基因片段及穿梭質粒載體片段，用T4 DNA連接酶進行連接，構建重組穿梭質粒。

3. 轉化與鑒定：將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，通過PCR及酶切鑒定篩選出陽性克隆，并進行測序驗證。

2.2 同源重組構建重組腺病毒質粒

1. 線性化穿梭質粒：用PmeⅠ酶切重組穿梭質粒，回收線性化穿梭質粒。

2. 化學轉化法同源重組：將線性化穿梭質粒與腺病毒骨架質粒在大腸桿菌BJ5183中進行同源重組，篩選出陽性克隆。

3. 鑒定與純化：通過PacⅠ酶切鑒定同源重組成功的質粒，并用大抽質粒試劑盒進行大量質粒抽提。

2.3 包裝與擴增重組腺病毒

1. 線性化重組腺病毒質粒：用PacⅠ酶切重組腺病毒質粒，回收線性化質粒。

2. 脂質體介導轉染293細胞：將線性化質粒用脂質體LipofectamineTM2000介導轉染至293細胞，進行包裝。

3. 觀察與收集病毒：觀察細胞病變效應（CPE），收集病變細胞，通過反復凍融、離心等方法制備病毒上清。

2.4 病毒純化與滴度測定

1. 病毒純化：采用碘克沙醇密度梯度離心或層析法純化病毒。

2. 滴度測定：通過實時熒光定量PCR法測定病毒滴度。

實驗結果

1. 重組腺病毒轉移質粒的構建

成功構建了攜帶目的基因的重組腺病毒轉移質粒，通過PCR及酶切鑒定，證實目的基因已成功插入穿梭質粒中。

2. 同源重組構建重組腺病毒質粒

采用化學轉化法，成功實現了穿梭質粒與腺病毒骨架質粒的同源重組，通過PacⅠ酶切鑒定，篩選出陽性克隆，獲得了重組腺病毒質粒。

3. 包裝與擴增重組腺病毒

將重組腺病毒質粒轉染293細胞，觀察到明顯的CPE，收集病變細胞制備病毒上清。通過反復凍融、離心等方法，成功獲得了重組腺病毒顆粒。

4. 病毒純化與滴度測定

采用碘克沙醇密度梯度離心或層析法純化病毒，獲得了高純度的重組腺病毒。通過實時熒光定量PCR法測定病毒滴度，結果顯示病毒滴度達到較高水平。

討論

1. 高效化學轉化重組法的優勢

本研究采用高效化學轉化重組法構建重組腺病毒，相比傳統方法，具有以下優勢：

• 簡化流程：減少了繁瑣的步驟，提高了構建效率。

• 降低成本：減少了試劑及材料的消耗，降低了實驗成本。

• 提高陽性重組率：通過優化同源重組條件，提高了陽性重組率，確保了實驗的可靠性。

2. 實驗策略的創新性

• 引入化學轉化法：將化學轉化法應用于同源重組，提高了重組效率。

• 優化純化方法：采用碘克沙醇密度梯度離心或層析法純化病毒，提高了病毒的純度及滴度。

• 多基因檢測：通過構建攜帶不同目的基因的重組腺病毒，驗證了該方法的通用性及適用性。

3. 應用前景

重組腺病毒作為基因治療的重要載體，具有廣闊的應用前景。本研究構建的高效化學轉化重組法，為制備具有更高抗腫瘤療效的生物治療制劑奠定了堅實基礎。該方法可廣泛應用于腫瘤基因治療、基因功能研究及疫苗開發等領域，具有重要的理論意義及實用價值。

結論

本研究采用高效化學轉化重組法成功構建了重組腺病毒，通過優化構建流程，提高了陽性重組率及構建效率。該方法具有成本低、效率高、操作簡便等優勢，為抗腫瘤生物治療制劑的制備提供了有力支持。未來，將進一步探索該方法的優化及應用，為基因治療研究做出更大貢獻。