重組hCGβ乳酸桿菌構建及其陰道免疫效能

引言

人絨毛膜促性腺激素β亞基（hCGβ）作為避孕疫苗的重要抗原，其單獨使用時的免疫原性較弱，難以誘導強烈的免疫反應。盡管基于hCGβ的避孕疫苗已被證實安全、有效且避孕效果可逆，但其總有效率僅為80%-85%，不能在生殖道局部產生足夠的抗原特異性抗體，這可能是避孕效果不完整的主要原因。乳酸桿菌作為人體的正常菌群，在粘膜局部持續表達抗原可誘發特異性免疫應答，因此被視為理想的疫苗載體。本研究旨在通過構建重組hCGβ乳酸桿菌，探索其經陰道粘膜免疫的可行性，以期為開發高效、安全的免疫避孕疫苗提供新的策略。

材料與方法

1. 材料

• 菌株與質粒：短小乳酸桿菌、干酪氏乳酸桿菌Lactobacillus casei CECT5276、pCMV4-hCGβ質粒、乳酸桿菌整合型表達載體pllac。

• 試劑：某品牌PCR試劑、某品牌DNA凝膠回收試劑盒、某品牌質粒提取試劑盒、某品牌放免試劑、某品牌Western blotting試劑、某品牌ELISA試劑。

• 儀器：某品牌PCR儀、某品牌電泳儀、某品牌離心機、威尼德電穿孔儀、某品牌酶標儀、某品牌Western blotting成像系統。

2. 方法

• 重組質粒構建：首先從短小乳酸桿菌基因組中PCR擴增得到670bp的S-層蛋白表達信號序列，將其信號肽序列與hCGβ基因連接后克隆入乳酸桿菌整合型表達載體pllac的lac啟動子下游，得到質粒pllac-hCGβ。

• 電穿孔轉化：將pllac-hCGβ電穿孔轉化干酪氏乳酸桿菌Lactobacillus casei CECT5276，得到重組菌Lb casei hCGβ。通過PCR及測序分析外源基因在乳酸桿菌基因組中的整合情況。

• 誘導表達與鑒定：在無選擇壓力條件下培養重組菌50代后，接種培養，加入誘導劑乳糖，通過放免法檢測培養上清及細胞裂解液中的hCGβ，Western blotting鑒定培養上清中的hCGβ蛋白。

• 動物實驗：將穩定、分泌性表達hCGβ的乳酸桿菌菌株經陰道免疫8周齡BALB/c雌性小鼠，檢測重組菌在小鼠陰道局部的抗原分泌水平及陰道局部特異性IgA抗體水平。

實驗結果

1. 重組乳酸桿菌的構建與鑒定

   通過PCR及測序分析，證實hCGβ基因已經成功整合到Lb. casei的基因組中。重組菌產生的目的蛋白有78.5%分泌進入培養上清。在加入誘導劑乳糖后21小時，上清中的hCGβ濃度達到峰值，為440mIU/ml。Western blot分析顯示22kDa的蛋白條帶，證實重組乳酸桿菌確實可分泌hCGβ蛋白抗原。

2. 重組乳酸桿菌的陰道免疫效能

   將重組乳酸桿菌接種于小鼠陰道后，第3、7天陰道洗液中可檢測到hCGβ，第14天陰道洗液中部分小鼠仍可檢測到hCGβ，說明該重組菌可在陰道粘膜定居，并分泌hCGβ蛋白。通過ELISA法檢測陰道洗液中的抗hCGβIgA抗體水平，結果顯示，用不同劑量的重組菌經陰道粘膜免疫小鼠后，陰道洗液中均可檢測到抗hCGβIgA抗體。

討論

1. 重組hCGβ乳酸桿菌的構建意義

   本研究成功構建了穩定分泌hCGβ的乳酸桿菌，通過調節培養條件優化了hCGβ的分泌效率。這不僅為hCGβ在乳酸桿菌中的表達提供了理論依據，也為進一步開發免疫避孕疫苗奠定了實驗基礎。

2. 陰道粘膜免疫的機制與效果

   乳酸桿菌作為陰道的正常菌群，具有良好的安全性和免疫調節作用。通過陰道粘膜免疫，重組乳酸桿菌能夠在生殖道局部產生高滴度的抗體，使抗生育作用更加直接、有效。本研究結果顯示，重組乳酸桿菌能夠有效誘導特異性IgA抗體的產生，驗證了其作為免疫避孕疫苗載體的可行性。

3. 研究的創新與應用前景

   本研究創新地將hCGβ與乳酸桿菌結合，通過粘膜免疫途徑誘導免疫反應，為免疫避孕疫苗的開發提供了新的策略。未來的研究可以進一步優化誘導條件，提高hCGβ的分泌量和穩定性，并探討其在不同動物模型中的免疫效果。此外，該策略還可能應用于其他粘膜免疫相關疾病的預防和治療，具有廣闊的應用前景。

結論

本研究成功構建了穩定分泌hCGβ的乳酸桿菌，并通過陰道粘膜免疫小鼠驗證了其免疫效能。實驗結果顯示，重組乳酸桿菌能夠在陰道粘膜局部定居并分泌hCGβ蛋白，有效誘導特異性IgA抗體的產生。這一研究不僅為hCGβ在乳酸桿菌中的表達提供了理論依據，也為進一步開發高效、安全的免疫避孕疫苗奠定了堅實的基礎。未來的研究將繼續優化誘導條件，探討其在不同動物模型中的免疫效果，并探索其在其他粘膜免疫相關疾病預防和治療中的應用潛力。