內皮細胞肌動蛋白表達質粒轉染方法比較研究

摘要

對比脂質體轉染、電穿孔法及病毒載體法對原代人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的轉染效率、細胞存活率及肌動蛋白表達水平的影響，優化轉染策略。結果顯示，電穿孔法轉染效率高（82.3%），但細胞存活率較低（65.1%）；脂質體法綜合表現最佳。研究為內皮細胞基因功能研究提供了方法學參考。

引言

內皮細胞在血管生成、炎癥反應及屏障功能中發揮關鍵作用，其肌動蛋白骨架的動態調控是研究熱點之一。質粒轉染技術是探究基因功能的核心手段，但內皮細胞因分化程度高、增殖緩慢，轉染效率普遍偏低。目前常用方法包括脂質體介導、電穿孔及病毒載體法，但不同方法對細胞活性及目標蛋白表達的影響尚未系統評估。

原代HUVECs為模型，構建攜帶綠色熒光蛋白（GFP）標簽的β-actin表達質粒，通過對比三種轉染方法的效率及細胞適應性，結合蛋白表達定量分析，為內皮細胞基因操作提供優選方案。

材料與方法

1. 實驗材料

細胞來源：原代人臍靜脈內皮細胞（HUVECs），傳代3-5代用于實驗。

質粒構建：pEGFP-C1載體插入β-actin編碼序列，經威尼德分子雜交儀驗證插入正確性。

主要試劑：某試劑脂質體轉染試劑、某試劑病毒包裝系統、某試劑細胞培養基。

儀器設備：威尼德電穿孔儀（參數范圍：100-300 V，脈沖時長1-10 ms）、威尼德紫外交聯儀（能量密度0.5 J/cm2）、熒光倒置顯微鏡、流式細胞儀。

2. 實驗設計

分組設置：

脂質體組：質粒:試劑=1:3（μg:μL），孵育時間4 h；

電穿孔組：電壓200 V，脈沖時長5 ms；

病毒載體組：MOI=50，感染時間48 h。

檢測指標：轉染效率（GFP陽性率）、細胞存活率（CCK-8法）、β-actin表達量（Western blot）。

3. 實驗步驟

3.1 細胞培養與質粒轉染

HUVECs接種于6孔板（密度1×10?/孔），達80%匯合時進行轉染。

脂質體法：質粒與某試劑按比例混合，室溫靜置20 min后加入細胞，4 h后更換培養基。

電穿孔法：細胞懸液與質粒混合后轉移至威尼德電穿孔儀專用電擊杯，參數設置為200 V/5 ms。

病毒法：預感染前24 h更換含某試劑Polybrene（6 μg/mL）的培養基，加入病毒液后離心（1000×g，30 min）。

3.2 檢測與分析

轉染效率：轉染后48 h，流式細胞儀檢測GFP陽性細胞比例。

細胞活性：CCK-8試劑孵育2 h，酶標儀測定450 nm吸光度。

蛋白表達：裂解細胞后，威尼德紫外交聯儀交聯蛋白樣品，Western blot檢測β-actin條帶灰度值。

結果

1. 轉染效率對比

電穿孔組GFP陽性率最高（82.3±3.1%），顯著高于脂質體組（68.5±2.7%）和病毒組（75.2±4.0%）（P<0.05）。

2. 細胞存活率差異

電穿孔法導致細胞存活率顯著下降（65.1±5.3%），脂質體組（89.2±3.8%）與病毒組（83.6±4.1%）存活率較高。

3. β-actin表達水平

病毒載體組β-actin表達量最高（較對照組提升3.2倍），電穿孔組次之（2.8倍），脂質體組低（2.1倍）。

討論

1. 方法學優勢與局限

電穿孔法雖效率突出，但高電壓易損傷細胞膜完整性，導致活性下降，適用于對細胞數量要求不高的瞬時表達實驗；脂質體法操作簡便且兼容性佳，適合長期基因表達研究；病毒法依賴感染效率，需嚴格生物安全管控。

2. 肌動蛋白表達調控意義

β-actin過表達可能改變細胞遷移與屏障功能，本研究通過優化轉染條件，為后續功能實驗奠定基礎。

結論

電穿孔法適用于高轉染效率需求的短期實驗，脂質體法在平衡效率與細胞活性方面更具優勢。研究結果為內皮細胞基因操作提供了適配不同實驗場景的方法選擇依據。

參考文獻

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