內蒙株細粒棘球蚴核酸疫苗構建與真核表達研究

摘要

內蒙株細粒棘球蚴抗原基因Eg95為靶點，通過分子克隆技術構建真核表達載體，利用威尼德電穿孔儀轉染HEK293T細胞，驗證抗原蛋白表達。動物實驗表明，核酸疫苗可誘導小鼠產生特異性抗體及Th1型免疫應答，為包蟲病防控提供新策略。

引言

細粒棘球蚴病（囊型包蟲病）是人畜共患寄生蟲病，流行于畜牧區，嚴重威脅公共衛生安全。傳統疫苗研發多依賴重組蛋白或滅活病原體，存在成本高、免疫原性不足等局限。核酸疫苗通過遞送抗原基因至宿主細胞，直接表達靶蛋白，可激活細胞與體液免疫雙重應答，具有高效、安全且易于規模化生產的潛力。內蒙株細粒棘球蚴Eg95抗原是疫苗設計的核心靶標，但其真核表達效率及免疫原性仍需系統評估。Eg95基因的密碼子優化、真核載體構建及哺乳動物細胞表達，結合動物模型驗證免疫效果，旨在為核酸疫苗開發提供實驗依據。

材料與方法

1. 實驗材料

1. 基因與載體：內蒙株細粒棘球蚴Eg95基因（GenBank登錄號：XXXXX），真核表達載體pVAX1。

2. 細胞與動物：HEK293T細胞（某試劑提供），6周齡BALB/c小鼠。

3. 主要儀器：威尼德電穿孔儀、威尼德紫外交聯儀、熒光顯微鏡、流式細胞儀。

4.試劑：限制性內切酶（某試劑）、質粒提取試劑盒（某試劑）、Western blot檢測試劑（某試劑）。

2. 實驗設計

2.1 Eg95基因優化與克隆
通過生物信息學分析Eg95基因序列，優化其密碼子以適應哺乳動物表達系統。設計特異性引物（正向：5’-XXX-3’，反向：5’-XXX-3’），以基因組DNA為模板進行PCR擴增。反應體系含某試劑DNA聚合酶，程序：94℃預變性5 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min，共35循環；72℃延伸10 min。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，膠回收純化后連接至pMD19-T載體。

2.2 真核表達載體構建
采用EcoRI和XhoI雙酶切pMD19-T-Eg95與pVAX1載體，威尼德紫外交聯儀檢測酶切效率。純化后片段經T4連接酶連接，轉化至DH5α感受態細胞。挑取單菌落擴增后提取質粒，通過PCR及測序驗證重組質粒pVAX1-Eg95的正確性。

2.3 細胞轉染與蛋白表達檢測
將HEK293T細胞接種于6孔板（密度1×10^6/孔），使用威尼德電穿孔儀轉染pVAX1-Eg95（參數：電壓120 V，脈沖時間20 ms）。轉染48 h后收集細胞：

熒光顯微鏡觀察：采用間接免疫熒光法，以Eg95多抗（某試劑）為一抗，FITC標記二抗（某試劑）檢測抗原表達。

Western blot分析：裂解細胞提取總蛋白，SDS-PAGE電泳后轉膜，一抗（1:1000）與HRP標記二抗（1:5000）孵育，ECL顯色。

2.4 動物免疫實驗
將30只BALB/c小鼠隨機分為3組（n=10）：

實驗組：肌肉注射pVAX1-Eg95（100 μg/只）；

空載體組：注射pVAX1（100 μg/只）；

空白組：注射PBS。
免疫程序為0、2、4周三次免疫。末次免疫后2周采集血清，ELISA檢測Eg95特異性IgG抗體（某試劑盒）；流式細胞術分析脾淋巴細胞中IFN-γ與IL-4分泌細胞比例。

結果

1. Eg95基因克隆與載體構建
PCR擴增獲得約450 bp的Eg95基因片段，測序證實與GenBank序列一致性達99.8%。重組質粒pVAX1-Eg95經雙酶切及測序驗證，顯示正確插入。

2. 抗原蛋白真核表達
免疫熒光顯示轉染細胞胞質內綠色熒光信號顯著；Western blot在約25 kDa處可見特異性條帶，與Eg95預測分子量一致。

3. 免疫應答效果
實驗組小鼠血清IgG抗體滴度較對照組顯著升高（P<0.01），且以IgG2a亞型為主；脾細胞中IFN-γ+細胞比例高于IL-4+細胞，表明Th1型免疫優勢。

討論

Eg95基因的真核高效表達，威尼德電穿孔儀顯著提升轉染效率。與傳統重組蛋白疫苗相比，核酸疫苗誘導的Th1型應答更利于抵抗胞內寄生蟲感染。此外，pVAX1載體安全性已獲FDA認可，為后續臨床試驗奠定基礎。

結論

基于內蒙株Eg95的核酸疫苗可有效激發特異性免疫應答，威尼德系列儀器在關鍵實驗環節中展現高穩定性。該研究為包蟲病疫苗開發提供了新思路，后續將優化佐劑配伍并評估長期保護效力。

參考文獻

1. 細粒棘球蚴內蒙株FABP基因cDNA的克隆與核酸疫苗的構建 [J] . 郝慧芳 ,王志鋼 ,李志偉 . 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志 . 2007,第4期

2. 四種乙肝核酸疫苗質粒的構建及在真核細胞中的表達 [J] . 何煦 ,趙連三 ,周陶友 . 華西醫學 . 2006,第3期

3. NDV長春株和四平株HN/F核酸疫苗的構建及表達 [J] . 龔偉 ,金寧一 ,薛立娟 . 中國獸醫學報 . 2002,第2期

4. 綿羊肺腺瘤病毒內蒙株衣殼蛋白在真核細胞中的表達 [J] . 斯日古楞 ,么宏強 ,馬學恩 . 中國獸醫雜志 . 2013,第008期

5. 狂犬病毒aG株核蛋白和糖蛋白雙表達質粒的構建及其在真核細胞中的表達 [J] . 楊卉娟 ,陳俊英 ,孫明波 . 中國生物制品學雜志 . 2006,第6期