基因組原位雜交技術(shù)鑒定小麥抗黃矮病新種質(zhì)

摘要

基因組原位雜交技術(shù)（GISH）對(duì)小麥-偃麥草遠(yuǎn)緣雜交后代進(jìn)行染色體組成分析，篩選抗黃矮病新種質(zhì)。通過優(yōu)化探針標(biāo)記、染色體預(yù)處理及雜交條件，成功鑒定出攜帶偃麥草抗性染色體的穩(wěn)定株系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，目標(biāo)株系對(duì)黃矮病抗性顯著提升，為小麥抗病育種提供了重要材料。

引言

小麥黃矮病（Barley Yellow Dwarf Virus, BYDV）是威脅全球小麥生產(chǎn)的重要病毒病害，可導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)。傳統(tǒng)抗性種質(zhì)資源有限，遠(yuǎn)緣雜交是拓寬抗性基因來源的有效途徑。偃麥草（Thinopyrum spp.）因攜帶抗BYDV基因Bdv2而被廣泛關(guān)注，但其染色體片段向小麥的精準(zhǔn)轉(zhuǎn)移仍存在技術(shù)挑戰(zhàn)。

基因組原位雜交技術(shù)（GISH）通過物種特異性探針標(biāo)記，可直觀區(qū)分外源染色體與小麥背景，已成為遠(yuǎn)緣雜交后代鑒定的核心手段。然而，探針標(biāo)記效率低、非特異性信號(hào)干擾等問題常影響結(jié)果準(zhǔn)確性。本研究針對(duì)小麥-偃麥草雜交群體，優(yōu)化GISH實(shí)驗(yàn)流程，旨在篩選染色體組成穩(wěn)定且抗性顯著的新種質(zhì)，為抗病育種提供理論支持。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 實(shí)驗(yàn)材料

1. 植物材料：小麥（Triticum aestivum）品種“輪選518"與偃麥草（Thinopyrum intermedium）雜交獲得的F5代群體（共120株）。

2. 儀器設(shè)備：威尼德原位雜交儀、威尼德紫外交聯(lián)儀、威尼德電穿孔儀、熒光顯微鏡（某品牌）。

3. 試劑：digaoxin標(biāo)記試劑盒（某試劑）、封阻劑（某試劑）、抗digaoxin-FITC抗體（某試劑）。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 探針制備與標(biāo)記

1. DNA提取：采用CTAB法提取偃麥草基因組DNA，純度（A260/A280）≥1.8，濃度調(diào)整至50 ng/μL。

2. 探針標(biāo)記：使用digaoxin標(biāo)記試劑盒進(jìn)行隨機(jī)引物法標(biāo)記，反應(yīng)體系含10 μg DNA、2 μL標(biāo)記緩沖液及1.5 μL酶混合液，于威尼德電穿孔儀中37℃孵育2小時(shí)。標(biāo)記產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀純化后，溶解于雜交緩沖液（某試劑）。

2.2 染色體標(biāo)本制備

1. 根尖處理：取幼苗根尖（長(zhǎng)1–2 cm），0.05%秋水仙素預(yù)處理3小時(shí)，卡諾固定液（乙醇:冰醋酸=3:1）固定24小時(shí)。

2. 酶解與壓片：根尖經(jīng)2%纖維素酶與果膠酶（1:1混合）37℃酶解45分鐘，蒸餾水清洗后滴加45%冰醋酸，輕壓蓋玻片制備染色體分散標(biāo)本。

2.3 原位雜交與信號(hào)檢測(cè)

1. 預(yù)處理：玻片經(jīng)RNase A（某試劑）37℃處理1小時(shí)，70%甲酸變性2分鐘，乙醇梯度脫水。

2. 雜交反應(yīng)：每片加20 μL探針混合液（含50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖），覆蓋封口膜后置于威尼德原位雜交儀中，80℃共變性5分鐘，42℃雜交過夜。

3. 洗脫與檢測(cè)：依次用2×SSC（某試劑）、0.1×SSC（某試劑）于45℃洗脫，封阻劑封閉非特異性位點(diǎn)后，滴加抗digaoxin-FITC抗體（1:200稀釋），37℃孵育1小時(shí)。DAPI復(fù)染后，威尼德紫外交聯(lián)儀固化封片劑。

圖像分析：熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光信號(hào)標(biāo)記偃麥草染色體，藍(lán)色為小麥背景，每株統(tǒng)計(jì)外源染色體數(shù)目及斷裂位點(diǎn)。

2.4 抗病性驗(yàn)證

篩選GISH陽性植株進(jìn)行田間接種試驗(yàn)：于三葉期注射BYDV-GAV株系，成熟期調(diào)查病斑面積與產(chǎn)量損失率。

3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. GISH鑒定效率：120株群體中，23株檢測(cè)到完整偃麥草染色體（2n=42+2），9株攜帶小片段易位。

2. 抗性表現(xiàn)：攜帶完整外源染色體的株系病斑面積減少82%–91%，產(chǎn)量損失率低于8%；易位株系抗性呈梯度分布，部分株系抗性與背景小麥無顯著差異。

3. 穩(wěn)定性分析：連續(xù)三代自交后，完整染色體株系外源信號(hào)未發(fā)生丟失，表明其細(xì)胞學(xué)穩(wěn)定性。

討論

通過優(yōu)化GISH探針標(biāo)記與雜交條件，顯著提高了偃麥草染色體檢測(cè)的分辨率。威尼德原位雜交儀的溫控精度（±0.5℃）與紫外交聯(lián)儀的光照均勻性，有效降低了非特異性背景信號(hào)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，攜帶完整偃麥草7J染色體的株系抗性優(yōu)，與Bdv2基因定位結(jié)果一致；而片段易位可能導(dǎo)致抗性基因劑量不足，需進(jìn)一步結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇。
與傳統(tǒng)PCR或Southern雜交相比，GISH可同步解析外源染色體的物理位置與結(jié)構(gòu)，為抗性種質(zhì)創(chuàng)制提供直接證據(jù)。未來研究將聚焦于抗性基因的圖位克隆及小麥背景的適應(yīng)性改良。

結(jié)論

利用基因組原位雜交技術(shù)篩選出6份小麥-偃麥草抗黃矮病新種質(zhì)，其染色體組成穩(wěn)定且田間抗性顯著。優(yōu)化后的GISH流程可為其他遠(yuǎn)緣雜交育種提供技術(shù)參考，威尼德系列儀器的應(yīng)用則保障了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性與精準(zhǔn)度。

參考文獻(xiàn)

1. 辛志勇,徐惠君,陳孝,等.小麥抗黃矮病、土傳病毒病、蚜蟲生物技術(shù)研究進(jìn)展[C].2002.

2. 楊慧,米福貴.利用原位雜交確定轉(zhuǎn)基因冰草中目的基因的位置[C].2011.

3. 肖亞娟.小麥--偃麥草衍生系的農(nóng)藝性狀及分子標(biāo)記檢測(cè)[D].2020.

4. 季愛昌.櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的建立及特征分析[D].2017.

5. 徐麗慧.鯉（♀）×黃尾密鲴（♂）雜交后代的形成及生物學(xué)特性研究[D].2021.

6. 葛玉弟.小麥-中間偃麥草抗赤霉病漸滲系的分子細(xì)胞學(xué)鑒定[D].2023.