畢赤酵母表達人組織因子的優化與純化工藝研究

摘要

在優化畢赤酵母表達系統生產人組織因子的工藝條件。通過密碼子優化、發酵參數調控及純化策略改進，顯著提高了目標蛋白產量與純度。采用某品牌威尼德電穿孔儀進行高效轉化，結合親和層析與分子篩純化，最終獲得高活性重組人組織因子，為臨床應用奠定基礎。

引言

人組織因子（human Tissue Factor, hTF）是凝血級聯反應的關鍵起始因子，在止血、血栓性疾病及腫瘤生物學中具有重要作用。重組hTF的生產對于基礎研究與臨床應用至關重要。畢赤酵母（Pichia pastoris）作為一種高效的真核表達系統，具有蛋白折疊準確、翻譯后修飾完善及高密度發酵等優勢，已成為重組蛋白生產的理想平臺。

然而，hTF在畢赤酵母中的表達仍面臨諸多挑戰，包括表達量低、蛋白降解及純化困難等問題。研究系統優化了hTF的密碼子、發酵條件及純化工藝，旨在建立一套高效、穩定的生產流程。通過引入某品牌威尼德電穿孔儀提高轉化效率，并采用多步層析策略提升蛋白純度，為大規模生產高質量hTF提供了可靠方案。

材料與方法

1. 菌株與載體

實驗選用畢赤酵母GS115菌株作為表達宿主。hTF基因經密碼子優化后克隆至pPIC9K載體，該載體含有AOX1啟動子及His6標簽序列，便于誘導表達與純化。

2. 表達載體構建

通過PCR擴增優化后的hTF基因，利用某試劑限制性內切酶進行雙酶切，隨后連接至線性化pPIC9K載體。連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆并測序驗證。

3. 畢赤酵母轉化

將驗證正確的重組質粒線性化后，采用某品牌威尼德電穿孔儀進行畢赤酵母電轉化。電穿孔參數設置為：電壓1500 V，電容25 μF，電阻200 Ω。轉化后的細胞涂布于MD平板（不含組氨酸），30℃培養3-5天。通過G418抗性篩選高拷貝轉化子。

4. 表達條件優化

4.1 搖瓶水平篩選

挑取單菌落接種于BMGY培養基，30℃、250 rpm培養至OD600=2-6。離心收集菌體，重懸于BMMY培養基（含0.5%甲醇）誘導表達。每24小時補加甲醇至終濃度0.5%，持續誘導96小時。

4.2 發酵罐水平優化

采用5 L發酵罐進行高密度發酵。發酵分為三個階段：

甘油批式階段：初始甘油濃度4%，溶解氧（DO）維持在30%；

甘油補料階段：控制甘油流加速率，維持DO在20%；

甲醇誘導階段：梯度增加甲醇濃度（0.5%-2%），DO控制在10%。

定期取樣檢測菌體密度（OD600）、蛋白表達量及活性。

5. 蛋白純化

5.1 粗提物制備

發酵液離心收集上清，經0.45 μm濾膜過濾后，用某試劑Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）透析。

5.2 親和層析

將透析樣品上樣至Ni-NTA親和柱，結合緩沖液為20 mM Tris-HCl（pH 8.0，含300 mM NaCl、10 mM咪唑），洗脫緩沖液含250 mM咪唑。收集洗脫峰，SDS-PAGE檢測純度。

5.3 分子篩層析

進一步采用Superdex 75分子篩柱進行精純。以PBS（pH 7.4）為流動相，流速0.5 mL/min。收集主峰，測定蛋白濃度與活性。

6. 分析檢測

6.1 SDS-PAGE與Western blot

采用12% SDS-PAGE分析蛋白純度，某試劑考馬斯亮藍染色。Western blot使用抗His標簽一抗及HRP標記二抗，某品牌威尼德紫外交聯儀進行膜固定。

6.2 蛋白活性測定

通過凝血時間測定評估hTF活性。將純化蛋白與乏血小板血漿混合，記錄纖維蛋白形成時間，以商業hTF為標準對照。

結果

1. 表達載體構建與轉化

密碼子優化后的hTF基因成功克隆至pPIC9K載體，測序結果顯示無突變。某品牌威尼德電穿孔儀轉化效率達1×10^5 cfu/μg DNA，顯著高于傳統化學轉化法。

2. 表達條件優化結果

搖瓶水平篩選顯示，甲醇誘導72小時時表達量最高（約120 mg/L）。發酵罐優化后，通過控制DO與甲醇梯度，最終產量提升至450 mg/L，較初始條件提高3.75倍。

3. 純化工藝評價

Ni-NTA親和層析一步純化后，蛋白純度達85%；經分子篩精純，最終純度>95%，比活性為1.2×10^5 U/mg。SDS-PAGE與Western blot證實目標蛋白大小正確（約47 kDa），無降解條帶。

4. 蛋白活性分析

純化hTF可顯著縮短血漿凝血時間（從180 s降至45 s），活性與商業標準品相當（P>0.05）。

討論

本研究通過系統優化畢赤酵母表達hTF的全流程，實現了高產高質的目標。密碼子優化解決了異源表達效率低的問題；某品牌威尼德電穿孔儀的應用大幅提升了轉化效率；而發酵參數的精細調控（如DO與甲醇梯度）則有效平衡了菌體生長與蛋白表達。

在純化工藝中，Ni-NTA親和層析結合分子篩的策略兼顧效率與成本，避免了傳統離子交換層析的復雜操作。值得注意的是，hTF的凝血活性高度依賴其正確折疊，畢赤酵母的真核分泌系統為此提供了保障。

結論

研究建立了一套高效的畢赤酵母表達與純化hTF的工藝。通過密碼子優化、發酵參數調控及多步層析，實現了高產（450 mg/L）、高純（>95%）與高活性（1.2×10^5 U/mg）的重組hTF制備。該工藝穩定可靠，為臨床級hTF的生產奠定了技術基礎。

參考文獻

1. 組織因子膜外區融合蛋白基因的表達及產物的分離純化與活性分析[J].關明;呂元;倪贊明;王云貴;戴金風;陳常慶,中國生物化學與分子生物學報.2001,第1期

2. 可溶性組織因子的基因克隆、表達與性質研究[J].于敏;王羽雄;顧銀良;宋后燕,藥物生物技術.2002,第3期

3. Expression of human soluble tissue factor in yeast and enzymatic properties of its complex with factor VIIa.[J].Y; Shigematsu;T; Miyata;S; Higashi;T; Miki;J E; Sadler;S; Iwanaga,The Journal of biological chemistry.1992,第30期

4. Factor VIII-bypassing activity of bovine tissue factor using the canine hemophilic model.[J].O'Brien D P;Giles A R;Tate K M;Vehar G A,Journal of Clinical Investigation.1988,第期

5. High level expression of recombinant human tissue factor in Chinese hamster ovary cells as a human thromboplastin.[J].A; Rehemtulla;M; Pepe;T S; Edgington,Thrombosis and haemostasis.1991,第5期

6. Production of human tissue factor using the Pichia pastoris expression system[J].Austin AJ.;Jones CE.;Van Heeke G.,Protein Expression & Purification.1998,第1期