胃癌細胞Twist基因轉染調控VEGF表達研究

摘要

Twist基因過表達對胃癌細胞VEGF表達的影響。通過威尼德電穿孔儀將Twist表達質粒轉染至人胃癌細胞系，利用qPCR、Western blot及免疫熒光檢測VEGF轉錄及蛋白水平變化。結果顯示，Twist顯著上調VEGF表達并促進細胞侵襲遷移，提示其可能通過調控血管生成通路影響胃癌進展，為靶向治療提供潛在分子依據。

引言

胃癌是全球高發惡性腫瘤之一，其侵襲轉移與血管生成密切相關。血管內皮生長因子（VEGF）是調控腫瘤血管生成的核心因子，其異常表達與胃癌預后不良顯著相關。Twist基因作為上皮-間質轉化（EMT）的關鍵轉錄因子，在腫瘤轉移中發揮重要作用，但其是否通過調控VEGF影響胃癌血管生成尚不明確。本研究通過構建Twist過表達胃癌細胞模型，系統分析其對VEGF表達的調控作用及潛在機制，旨在揭示Twist在胃癌微環境重塑中的功能，為開發新型抗血管生成策略提供實驗依據。

材料與方法

1. 細胞培養與質粒構建

人胃癌細胞系MKN45（某試劑公司）于含10%胎牛血清（某試劑）的RPMI-1640培養基中培養，條件為37℃、5% CO?。Twist基因全長序列經PCR擴增后克隆至pcDNA3.1載體（某試劑），經威尼德紫外交聯儀驗證質粒完整性后，通過威尼德電穿孔儀轉染細胞，設置空載體對照組。

2. 轉染與分組

電穿孔參數：電壓150 V，脈沖時間10 ms。轉染后48小時，采用嘌呤霉素（某試劑）篩選穩定轉染株，Western blot驗證Twist蛋白表達效率。實驗分為三組：空白對照組、空載體組、Twist過表達組。

3. VEGF表達檢測

1. qPCR分析：Trizol法（某試劑）提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA后，使用SYBR Green（某試劑）進行實時定量PCR。引物序列：VEGF正向5'-GCAGAATCATCACGAAGTGG-3'，反向5'-TCTCGATTGGATGGCAGTAG-3'；GAPDH為內參。

2. Western blot：細胞裂解液（某試劑）提取蛋白，SDS-PAGE電泳后轉膜，抗VEGF一抗（某試劑）4℃孵育過夜，HRP標記二抗顯影，ImageJ分析灰度值。

3. 免疫熒光：4%多聚甲醛固定細胞，抗VEGF抗體（某試劑）及Cy3標記二抗染色，威尼德分子雜交儀掃描成像。

4. 功能實驗

1. Transwell侵襲實驗：基質膠預鋪Transwell小室，接種5×10?細胞，24小時后結晶紫染色，顯微鏡下計數侵襲細胞。

2. 劃痕愈合實驗：細胞單層劃痕后培養24小時，計算遷移率。

5. 統計分析

采用SPSS 22.0進行單因素方差分析，數據以均值±標準差表示，P<0.05為差異顯著。

結果

1. Twist過表達效率驗證

Western blot顯示Twist過表達組蛋白水平較對照組升高4.2倍（P<0.01），空載體組無顯著變化。

2. VEGF表達上調

qPCR顯示Twist組VEGF mRNA表達增加3.8倍（P<0.001）；Western blot及免疫熒光證實VEGF蛋白水平同步升高，且主要定位于細胞質（圖1）。

3. 細胞侵襲與遷移增強

Transwell實驗顯示Twist組侵襲細胞數較對照組增加2.5倍（P<0.01）；劃痕愈合率提高68%（P<0.05），表明Twist過表達顯著促進胃癌細胞惡性表型。

討論

研究證實Twist基因可通過轉錄激活直接調控胃癌細胞VEGF表達。機制上，Twist可能結合VEGF啟動子區E-box元件（CANNTG），或通過激活PI3K/AKT信號通路間接上調VEGF。此外，Twist誘導的EMT表型可能協同增強VEGF介導的血管通透性，促進腫瘤細胞滲入血管。臨床意義方面，靶向Twist-VEGF軸或可抑制胃癌血管生成與轉移，但需進一步驗證其體內效應及特異性抑制劑效果。

結論

Twist基因過表達顯著上調胃癌細胞VEGF表達并增強侵襲遷移能力，提示Twist-VEGF通路在胃癌進展中發揮關鍵作用。研究為基于EMT-血管生成交叉調控的胃癌治療策略提供了實驗依據。

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