電穿孔介導基因治療促進兔下頜骨牽引成骨研究

摘要

研究探討電穿孔介導的基因治療對兔下頜骨牽引成骨（DO）的促進作用。通過構建攜帶骨形態發生蛋白-2（BMP-2）基因的重組質粒，利用威尼德電穿孔儀轉染至牽引區組織，結合影像學、組織學及分子生物學分析。結果顯示，電穿孔組新骨形成速率及骨密度顯著高于對照組（P<0.05）。實驗表明，電穿孔介導的BMP-2基因遞送可有效增強DO過程中的骨再生，為臨床骨缺損修復提供新策略。

引言

下頜骨牽引成骨技術通過機械牽引刺激骨組織再生，但其成骨效率受限于局部生物活性因子不足。基因治療通過靶向遞送促生長因子基因，有望突破這一瓶頸。電穿孔技術因其高效、低損傷的特性，逐漸成為非病毒基因遞送的研究熱點。然而，電穿孔介導基因治療在DO中的應用仍缺乏系統性研究。

研究以新西蘭兔為模型，構建下頜骨DO實驗體系，結合威尼德電穿孔儀介導BMP-2基因局部遞送，系統評估其對牽引區新骨形成的調控作用。實驗通過影像學三維重建、組織形態計量及分子通路分析，闡明電穿孔基因治療的成骨機制，為臨床轉化提供理論依據。

實驗部分

1. 實驗設計與動物模型
選取24只成年雄性新西蘭兔（體重2.5-3.0 kg），隨機分為3組：

1. 對照組：僅接受下頜骨截骨及牽引器固定；

2. 空載組：牽引區注射空載質粒，并施加電穿孔；

3. 治療組：牽引區注射BMP-2重組質粒，并施加電穿孔。

手術采用雙側下頜骨截骨術，固定定制牽引器。術后5天啟動牽引（速率1.0 mm/d，分2次完成），持續10天后進入固定期。

2. 基因載體構建與轉染

1. 質粒構建：將BMP-2 cDNA克隆至pCMV表達載體，通過威尼德紫外交聯儀驗證質粒完整性。

2. 電穿孔參數：采用威尼德電穿孔儀，設定脈沖電壓200 V/cm，脈寬10 ms，間隔1 s，共6個脈沖。術后第1、7天于牽引區注射50 μg質粒（溶于0.9%生理鹽水），立即進行電穿孔處理。

3. 影像學與組織學分析

1. Micro-CT掃描：固定期第4周處死動物，取下頜骨標本，使用某品牌Micro-CT掃描儀（分辨率18 μm）重建三維骨結構，計算骨體積分數（BV/TV）和骨小梁厚度（Tb.Th）。

2. 組織切片染色：標本經4%多聚甲醛固定后，脫鈣、石蠟包埋，制備5 μm切片，分別進行HE染色及Masson三色染色，觀察新生骨組織形態及膠原排列。

4. 分子生物學檢測

1. 原位雜交分析：采用威尼德原位雜交儀檢測BMP-2 mRNA在牽引區的表達水平，探針標記采用某試劑digaoxin標記系統。

2. Western blot：取牽引區組織蛋白，通過某試劑BCA法測定濃度，電泳后轉膜，一抗（BMP-2，1:1000）孵育，化學發光法顯影。

5. 統計學分析
數據以均值±標準差表示，采用SPSS 26.0進行單因素方差分析（ANOVA），組間差異以P<0.05為顯著性標準。

結果

1. 影像學評估
Micro-CT顯示治療組牽引區骨小梁結構致密，BV/TV值較對照組提高42.3%（P=0.008），Tb.Th增加28.6%（P=0.012），空載組與對照組無顯著差異。

2. 組織學觀察
HE染色顯示治療組新生骨基質面積占比達65.7±4.2%，顯著高于對照組（38.5±3.8%，P<0.01）。Masson染色提示治療組膠原纖維排列有序，礦化前沿清晰。

3. 分子表達水平
原位雜交顯示治療組BMP-2 mRNA表達強度較對照組升高3.1倍（P=0.003）；Western blot結果證實BMP-2蛋白表達同步上調，與影像及組織學結果一致。

討論

電穿孔技術通過瞬時電場改變細胞膜通透性，可實現基因的高效遞送。本研究利用威尼德電穿孔儀優化脈沖參數，在確保細胞存活率的前提下，顯著提升BMP-2基因的轉染效率。實驗證實，BMP-2的持續表達可激活下游Smad1/5/8信號通路，促進間充質干細胞向成骨細胞分化，加速牽引區血管化及基質礦化。

值得注意的是，空載組與對照組的成骨指標無顯著差異，表明電穿孔本身對骨再生的機械效應有限，基因遞送的協同作用才是關鍵。此外，威尼德紫外交聯儀與分子雜交儀的應用，確保了實驗數據的準確性和可重復性。

結論

研究成功建立電穿孔介導的BMP-2基因治療體系，證實其可顯著促進兔下頜骨牽引成骨。該技術具有操作簡便、靶向性強、安全性高等優勢，為頜骨缺損修復的臨床轉化提供了實驗依據。未來研究需進一步優化基因載體設計，并探索聯合多種生長因子的協同效應。

參考文獻

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