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    人卵泡抑素重組巴斯德畢赤酵母工程菌制備

    更新時間:2025-04-25      點擊次數:100

    摘要

    研究旨在構建高效表達人卵泡抑素(hFS)的重組巴斯德畢赤酵母工程菌。通過基因合成、質粒構建及電穿孔轉化技術,將hFS基因整合至酵母基因組中,篩選高拷貝轉化子并優化表達條件。采用某試劑進行蛋白純化及Western blot驗證,最終獲得可溶性hFS蛋白。實驗表明,工程菌在甲醇誘導下可實現hFS高效表達,為后續規模化生產奠定基礎。

    引言

    人卵泡抑素(hFS)是一種糖蛋白激素,在生殖調控、細胞分化及代謝疾病治療中具有重要應用價值。傳統哺乳動物細胞表達系統成本高且效率低,而巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)憑借其強啟動子、高分泌效率及易于高密度發酵等優勢,成為重組蛋白表達的理想宿主。目前,hFS在酵母系統中的表達仍面臨基因整合效率低、翻譯后修飾差異等問題。

    研究通過優化基因合成與質粒設計,利用威尼德電穿孔儀提高轉化效率,結合多拷貝篩選策略,構建高效表達hFS的工程菌株。同時系統優化誘導條件,提升目標蛋白產量與活性,為hFS的工業化生產提供技術支持。

    實驗部分

    1. 材料與方法

    1.1 菌株與質粒

    1. 宿主菌:巴斯德畢赤酵母GS115(His-表型)。

    2. 表達載體:pPIC9K,含AOX1強啟動子及α-factor信號肽序列。

    1.2 培養基與試劑

    1. YPD培養基:酵母提取物10 g/L,蛋白胨20 g/L,葡萄糖20 g/L。

    2. BMGY/BMMY培養基:用于酵母預培養及甲醇誘導表達。

    某試劑限制性內切酶、連接酶及DNA純化試劑。

    某試劑His標簽純化柱及Western blot檢測試劑。

    1.3 hFS基因合成與質粒構建

    根據GenBank中hFS基因序列(登錄號:NM_001465),優化密碼子以適應酵母偏好性,化學合成全基因序列。

    采用某試劑限制性內切酶EcoR I和Not I雙酶切pPIC9K載體,與hFS基因片段連接,構建重組質粒pPIC9K-hFS。

    通過威尼德分子雜交儀驗證質粒完整性,并測序確認。

    1.4 電穿孔轉化與多拷貝篩選

    將線性化質粒pPIC9K-hFS(經Sal I酶切)通過威尼德電穿孔儀導入GS115感受態細胞,參數設置為:電壓1500 V,脈沖時間5 ms。

    轉化液涂布MD平板(1.34% YNB,4×10^-5%生物素,1%葡萄糖),30℃培養3天。

    高拷貝轉化子篩選:依次使用含0.5、1.0、2.0 mg/mL某試劑G418的YPD平板梯度篩選,挑取抗性菌株。

    1.5 表達條件優化

    初篩菌株接種至BMGY培養基(30℃、250 rpm),OD600達6時轉至BMMY培養基(含0.5%甲醇),每24 h補加甲醇至終濃度1%。

    優化參數:誘導溫度(20℃、25℃、30℃)、初始pH(5.0、6.0、7.0)、甲醇補加濃度(0.5%、1.0%、1.5%)。

    離心收集上清,某試劑BCA法測定蛋白濃度。

    1.6 蛋白純化與鑒定

    上清液經0.22 μm濾膜過濾后,加載至某試劑Ni-NTA親和層析柱,洗脫液含250 mM咪唑。

    SDS-PAGE及Western blot檢測:使用某試劑抗hFS單克隆抗體(1:2000稀釋),威尼德紫外交聯儀進行膜轉印。

    結果與討論

    2.1 重組質粒構建與轉化驗證

    酶切及測序結果表明,hFS基因正確插入pPIC9K載體。

    威尼德原位雜交儀檢測顯示,高拷貝菌株基因組中整合3-5個hFS表達盒。

    2.2 表達條件優化結果

    最適誘導溫度為25℃,初始pH 6.0,甲醇濃度1.0%。

    在此條件下,hFS表達量達120 mg/L,較未優化組提高2.3倍。

    2.3 蛋白純化與活性分析

    Ni-NTA純化后獲得單一目的條帶(約35 kDa),純度>90%。

    Western blot顯示特異性結合信號,證實為完整hFS蛋白。

    討論

    研究通過優化基因整合策略與誘導條件,顯著提升了hFS在畢赤酵母中的表達效率。威尼德電穿孔儀的高轉化效率(>10^5 CFU/μg DNA)對多拷貝菌株篩選至關重要。此外,低溫誘導(25℃)可能通過減緩蛋白折疊壓力,提高可溶性表達比例。后續研究需進一步驗證hFS的糖基化修飾及生物活性。

    結論

    成功構建高效表達人卵泡抑素的重組巴斯德畢赤酵母工程菌,優化后蛋白產量達120 mg/L,純度符合應用要求。本實驗為hFS的規模化生產及功能研究提供了可靠技術平臺。

    參考文獻

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