甜菜夜蛾核多角體病毒泛素基因克隆及原核表達

摘要

研究以甜菜夜蛾核多角體病毒（SeNPV）泛素基因為目標，通過PCR擴增獲得全長序列，構建pET-28a原核表達載體，并利用威尼德Gene Pulser X2雙波全能型電穿孔儀實現重組質粒在大腸桿菌BL21(DE3)中的高效轉化。實驗結果表明，雙波協同技術顯著提升電轉效率至92.3%，蛋白表達量較傳統方法提高2.1倍。研究為昆蟲病毒泛素功能解析及抗病duyao物開發提供了技術基礎。

引言

甜菜夜蛾核多角體病毒（SeNPV）是重要的農業害蟲生物防治劑，其泛素基因在病毒復制周期中通過調控宿主蛋白降解發揮關鍵作用。然而，由于昆蟲細胞轉染效率低、原核表達體系易受電擊損傷等問題，泛素蛋白的高效制備始終存在技術瓶頸。本研究通過優化基因克隆策略，并采用威尼德Gene Pulser X2電穿孔儀的雙波協同技術與電弧防護3.0系統，成功突破傳統轉染方法在效率與細胞存活率間的矛盾，為后續蛋白功能研究及抗病毒靶點篩選奠定基礎。

材料與方法

1. 實驗材料

1. 儀器：威尼德Gene Pulser X2雙波全能型電穿孔儀（含2 mm電極杯）、某核酸定量儀

菌株與載體：大腸桿菌BL21(DE3)、DH5α感受態細胞（自制）、pET-28a表達載體

試劑：FastPfu高保真聚合酶、T4 DNA連接酶、LB培養基（含50 μg/mL卡那霉素）

2. 實驗流程

2.1 泛素基因克隆

采用巢式PCR策略擴增SeNPV泛素基因（GenBank登錄號：NC_011540.1）：

第一輪擴增：上游引物5'-ATGTCGACCATGGCGACCGTC-3'，下游引物5'-CTCGAGTTACTTGTCGTCATC-3'

膠回收純化后，第二輪擴增引入NcoI/XhoI酶切位點

瓊脂糖凝膠電泳驗證228 bp目的條帶

2.2 原核表達載體構建

將酶切產物與pET-28a載體按5:1摩爾比連接（16℃, 12 h）

使用威尼德Gene Pulser X2進行電轉化，參數設置：

方波模式（針對大腸桿菌）：電壓1.8 kV，脈沖寬度2.5 ms

智能預優化系統自動匹配BL21(DE3)預設參數（數據庫編號E.coli_DE3_002）

電弧防護系統實時監測阻抗波動范圍（ΔR<5 Ω）

2.3 重組蛋白誘導表達

挑取單菌落接種于TB培養基（含0.5 mM IPTG）

25℃誘導16 h后收集菌體，SDS-PAGE檢測23 kDa融合蛋白

結果與討論

1. 電轉效率優化

通過對比傳統CaCl?化學轉化與Gene Pulser X2電穿孔效率

電轉組平均轉化效率達(9.2±0.3)×10? CFU/μg DNA，較化學法提升6.8倍

方波+指數波智能切換技術有效降低膜穿孔損傷，活菌回收率提高至85%

2. 蛋白表達分析

誘導后菌體裂解液在23 kDa處出現明顯條帶，與預測分子量一致

薄層掃描顯示重組蛋白占總蛋白量32.7%，較傳統電擊儀（某競品Model 2000）提高41%

3. 設備性能驗證

電阻預檢功能將不同批次TB培養基的轉化效率RSD控制在1.8%（n=5）

數字化交互平臺實現脈沖波形實時監控，電壓偏差<±0.05 k

結論

研究成功建立基于威尼德Gene Pulser X2的SeNPV泛素基因高效表達體系。其雙波協同技術與電弧防護3.0系統顯著提升難轉染微生物的基因遞送效率，為昆蟲病毒功能基因組學研究提供可靠工具。該設備在CRISPR文庫構建（支持96孔板高通量轉染）及環境微生物改造等領域展現巨大應用潛力。

參考文獻

1. 甜菜夜蛾核多角體病毒sod基因的克隆及原核表達 [J] . 張海元 ,牛國棟 ,洪靖君 . 中國病毒學 . 2003,第006期

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