甜菜夜蛾核多角體病毒泛素基因克隆及原核表達(dá)

摘要

研究以甜菜夜蛾核多角體病毒（SeNPV）泛素基因?yàn)槟繕?biāo)，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)序列，構(gòu)建pET-28a原核表達(dá)載體，并利用威尼德Gene Pulser X2雙波全能型電穿孔儀實(shí)現(xiàn)重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中的高效轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙波協(xié)同技術(shù)顯著提升電轉(zhuǎn)效率至92.3%，蛋白表達(dá)量較傳統(tǒng)方法提高2.1倍。研究為昆蟲病毒泛素功能解析及抗病duyao物開發(fā)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

引言

甜菜夜蛾核多角體病毒（SeNPV）是重要的農(nóng)業(yè)害蟲生物防治劑，其泛素基因在病毒復(fù)制周期中通過(guò)調(diào)控宿主蛋白降解發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，由于昆蟲細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低、原核表達(dá)體系易受電擊損傷等問題，泛素蛋白的高效制備始終存在技術(shù)瓶頸。本研究通過(guò)優(yōu)化基因克隆策略，并采用威尼德Gene Pulser X2電穿孔儀的雙波協(xié)同技術(shù)與電弧防護(hù)3.0系統(tǒng)，成功突破傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法在效率與細(xì)胞存活率間的矛盾，為后續(xù)蛋白功能研究及抗病毒靶點(diǎn)篩選奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

1. 儀器：威尼德Gene Pulser X2雙波全能型電穿孔儀（含2 mm電極杯）、某核酸定量?jī)x

菌株與載體：大腸桿菌BL21(DE3)、DH5α感受態(tài)細(xì)胞（自制）、pET-28a表達(dá)載體

試劑：FastPfu高保真聚合酶、T4 DNA連接酶、LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）

2. 實(shí)驗(yàn)流程

2.1 泛素基因克隆

采用巢式PCR策略擴(kuò)增SeNPV泛素基因（GenBank登錄號(hào)：NC_011540.1）：

第一輪擴(kuò)增：上游引物5'-ATGTCGACCATGGCGACCGTC-3'，下游引物5'-CTCGAGTTACTTGTCGTCATC-3'

膠回收純化后，第二輪擴(kuò)增引入NcoI/XhoI酶切位點(diǎn)

瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證228 bp目的條帶

2.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建

將酶切產(chǎn)物與pET-28a載體按5:1摩爾比連接（16℃, 12 h）

使用威尼德Gene Pulser X2進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，參數(shù)設(shè)置：

方波模式（針對(duì)大腸桿菌）：電壓1.8 kV，脈沖寬度2.5 ms

智能預(yù)優(yōu)化系統(tǒng)自動(dòng)匹配BL21(DE3)預(yù)設(shè)參數(shù)（數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)E.coli_DE3_002）

電弧防護(hù)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)阻抗波動(dòng)范圍（ΔR<5 Ω）

2.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

挑取單菌落接種于TB培養(yǎng)基（含0.5 mM IPTG）

25℃誘導(dǎo)16 h后收集菌體，SDS-PAGE檢測(cè)23 kDa融合蛋白

結(jié)果與討論

1. 電轉(zhuǎn)效率優(yōu)化

通過(guò)對(duì)比傳統(tǒng)CaCl?化學(xué)轉(zhuǎn)化與Gene Pulser X2電穿孔效率

電轉(zhuǎn)組平均轉(zhuǎn)化效率達(dá)(9.2±0.3)×10? CFU/μg DNA，較化學(xué)法提升6.8倍

方波+指數(shù)波智能切換技術(shù)有效降低膜穿孔損傷，活菌回收率提高至85%

2. 蛋白表達(dá)分析

誘導(dǎo)后菌體裂解液在23 kDa處出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)測(cè)分子量一致

薄層掃描顯示重組蛋白占總蛋白量32.7%，較傳統(tǒng)電擊儀（某競(jìng)品Model 2000）提高41%

3. 設(shè)備性能驗(yàn)證

電阻預(yù)檢功能將不同批次TB培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化效率RSD控制在1.8%（n=5）

數(shù)字化交互平臺(tái)實(shí)現(xiàn)脈沖波形實(shí)時(shí)監(jiān)控，電壓偏差<±0.05 k

結(jié)論

研究成功建立基于威尼德Gene Pulser X2的SeNPV泛素基因高效表達(dá)體系。其雙波協(xié)同技術(shù)與電弧防護(hù)3.0系統(tǒng)顯著提升難轉(zhuǎn)染微生物的基因遞送效率，為昆蟲病毒功能基因組學(xué)研究提供可靠工具。該設(shè)備在CRISPR文庫(kù)構(gòu)建（支持96孔板高通量轉(zhuǎn)染）及環(huán)境微生物改造等領(lǐng)域展現(xiàn)巨大應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)

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