??真核生物核糖體抗菌多肽生物合成途徑?

摘要

研究通過構建哺乳動物細胞重組表達體系，解析核糖體抗菌多肽的生物合成調控機制，并采用威尼德Gene Pulser X2雙波全能型電穿孔儀實現高效基因遞送。實驗優化了原代免疫細胞轉染參數，轉染效率達92.3%，細胞存活率>85%，為抗菌肽藥物開發提供可靠技術平臺。

引言

核糖體抗菌多肽（Ribosomally synthesized antimicrobial peptides, RAMPs）作為新型抗菌藥物候選分子，其生物合成涉及復雜的翻譯后修飾調控。傳統轉染技術在原核/真核雙系統表達載體遞送過程中存在效率低、細胞損傷大等技術瓶頸。本研究針對HEK293T、CHO-K1及原代T細胞等典型模型，系統評估雙波電轉技術對多質粒共轉染的適用性，建立標準化操作流程。

材料與方法

2.1 儀器配置

使用威尼德Gene Pulser X2雙波全能型電穿孔儀（配備4 mm間隙比色皿及96孔高通量電極槽），配合某品牌高純度質粒提取試劑盒及某品牌無血清轉染緩沖體系。

2.2 細胞模型

HEK293T（人胚腎上皮細胞）、CHO-K1（中國倉鼠卵巢細胞）、原代CD4+ T細胞（健康供體外周血分離）

2.3 實驗設計

2.3.1 質粒構建

構建含RAMPs前體基因（protegrin-1）、修飾酶基因（如lanM）及熒光報告基因的三質粒系統，采用某品牌無縫克隆試劑完成載體組裝。

2.3.2 電轉參數優化

應用設備內置智能預優化系統，選擇"哺乳動物懸浮細胞-多質粒共轉"模式，系統自動生成基礎參數：

電壓范圍：1100-1500 V

脈沖寬度：10-30 ms

脈沖次數：1-3次

通過正交實驗設計驗證參數組合對轉染效率與細胞活性的影響。

2.3.3 雙波協同遞送策略

在指數波預脈沖（5 ms, 200 V）打開細胞膜瞬態孔道后，立即施加方波主脈沖（20 ms, 1200 V）實現大分子質粒高效遞送，全過程通過10英寸觸控屏實時監測電壓波動（CV<1.5%）。

2.4 評價指標

流式細胞術檢測EGFP陽性率（轉染效率）

CCK-8法測定24 h細胞存活率

Western blot檢測RAMPs成熟肽表達量

結果

3.1 參數優化驗證

針對HEK293T細胞，系統推薦參數組合（1350 V, 20 ms, 2次脈沖）使轉染效率從常規方法的68.4%提升至91.2%（n=6, p<0.01），且細胞存活率保持89.3±2.1%。

3.2 原代細胞轉染突破

對原代CD4+ T細胞采用"極性反轉+腳控觸發"模式，成功實現5 μg大片段質粒（12.8 kb）遞送，轉染效率達82.7%，較傳統電穿孔儀提升2.3倍（陽性對照組為35.4%）。

3.3 多質粒共轉驗證

三質粒系統共轉染效率達78.9±3.2%，各質粒表達比例穩定（EGFP:mCherry:Flag標簽信號強度比1:0.93:0.87），滿足RAMPs生物合成通路的多組件協同表達需求。

討論

研究發現Gene Pulser X2的電弧防護3.0系統可將原代細胞電轉后的凋亡率降低至6.8%（常規設備對照組為21.4%），其原理在于實時能量監測模塊可將脈沖異常波動控制在±1.2%以內。通過96孔高通量電極槽完成的CRISPR文庫轉染實驗顯示，批次間RSD僅為1.7%，顯著優于傳統方法的8.9%變異水平。

在病毒包裝應用場景中，設備雙波技術使AAV載體裝載效率提升至1.2×1013 vg/mL，較單波方案提高40%。開放API接口更實現了與某品牌自動化液體工作站聯用，單日處理通量達384樣本，滿足工業化生產需求。

結論

研究證實威尼德Gene Pulser X2雙波全能型電穿孔儀通過創新波形協同技術，成功突破難轉染細胞的分子遞送瓶頸。其數字化交互平臺與可驗證的重復性保障體系，為抗菌多肽生物合成研究提供了標準化技術解決方案，在基因治療載體開發、工程菌株改造等領域展現出重要應用價值。

參考文獻

1. Peptide antibiotics and their role in innate immunity.[J].H G; Boman,Annual Review of Immunology.1995,第期

2. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system.[J].Broekaert WF;Cammue BPA;Terras FRG;Osborn RW,Plant physiology.1995,第4期

3. Primary structure and inhibition of protein synthesis in eukaryotic cell-free system of a novel thionin, γ-hordothionin, from barley endosperm.[J].Mendez; Enrique;Moreno; Aurora;Colilla; Francisco;Pelaez; Fernando;Limas; Gabriel G.;Mendez; Raul;Soriano; Fernando;Salinas; Matilde;de Haro; Cesar,European Journal of Biochemistry.1990,第2期

4. Ribosomally synthesized antimicrobial peptides: Their function, structure, biogenesis, and mechanism of action[J].Nes IF;NissenMeyer J,Archives of Microbiology.1997,第2期