丙型肝炎病毒非結構蛋白4B轉染細胞差異表達基因篩選研究

摘要

探究丙型肝炎病毒（HCV）非結構蛋白4B（NS4B）對宿主細胞基因表達的影響。通過構建NS4B真核表達載體，利用威尼德電穿孔儀轉染Huh-7細胞，結合轉錄組測序技術篩選差異表達基因（DEGs）。結果顯示，NS4B顯著調控細胞凋亡、免疫應答及脂代謝相關通路。實驗揭示了NS4B在HCV致病機制中的潛在作用，為抗病毒靶點開發提供了理論依據。

引言

丙型肝炎病毒（HCV）感染是全球慢性肝病的主要病因之一，可導致肝硬化及肝癌。其非結構蛋白NS4B作為病毒復制復合體的核心組分，參與內質網膜結構的重塑，但NS4B對宿主細胞基因表達的調控機制尚不明確。已有研究表明，NS4B可能通過干擾宿主信號通路促進病毒持續感染，但其具體靶基因及功能網絡仍待解析。本研究通過轉染NS4B至肝源性細胞系，結合高通量測序技術系統篩選差異表達基因，旨在闡明NS4B的宿主互作機制，為HCV治療策略提供新方向。

實驗部分

1. 實驗材料與儀器

細胞與載體：人肝癌細胞系Huh-7（某試劑培養），pcDNA3.1-NS4B真核表達載體（某試劑合成）。

主要儀器：威尼德電穿孔儀（轉染效率優化至75%）、威尼德紫外交聯儀（核酸固定）、威尼德分子雜交儀（Southern blot驗證）。

2. 實驗方法

（1）NS4B表達載體構建與驗證

通過PCR擴增HCV NS4B編碼序列（基因型1b），克隆至pcDNA3.1載體。利用威尼德原位雜交儀進行限制性酶切及連接反應，產物經測序確認無誤后，使用某試劑純化質粒。

（2）細胞轉染與分組

將Huh-7細胞分為實驗組（轉染pcDNA3.1-NS4B）和對照組（空載體）。采用威尼德電穿孔儀（參數：電壓120 V，脈沖時長20 ms）進行轉染，轉染后48小時收集細胞。

（3）RNA提取與轉錄組測序

使用某試劑提取總RNA，Agilent 2100生物分析儀檢測RNA完整性（RIN≥8.0）。建庫后于Illumina NovaSeq平臺進行雙端測序（讀長150 bp），數據經質控后比對至人類參考基因組（GRCh38）。

（4）差異表達基因篩選與分析

通過DESeq2軟件（|log2FC|>1，p<0.05）篩選DEGs，利用DAVID數據庫進行GO功能注釋及KEGG通路富集分析。關鍵基因通過qRT-PCR驗證（某試劑SYBR Green Mix）。

（5）蛋白質互作網絡構建

基于STRING數據庫構建DEGs編碼蛋白的互作網絡，Cytoscape軟件可視化并篩選核心節點基因。

結果

1. NS4B轉染效率與細胞表型

威尼德電穿孔儀轉染后，Western blot證實NS4B在Huh-7細胞中高效表達。與對照組相比，實驗組細胞增殖速率下降20%（p<0.01），凋亡率增加35%。

2. 差異表達基因篩選

轉錄組分析共鑒定到682個DEGs，其中上調基因412個（如CASP3、STAT1），下調基因270個（如PPARG、FASN）。

3. 功能富集與通路分析

GO分析表明，DEGs主要參與“凋亡信號調控"（p=3.2×10^-5）和“先天免疫應答"（p=1.8×10^-4）。KEGG通路中，“丙型肝炎感染通路"（p=0.002）和“PPAR信號通路"（p=0.005）顯著富集。

4. 核心基因驗證

qRT-PCR證實CASP3、STAT1表達上調2.5倍（p<0.001），PPARG下調1.8倍（p<0.01），與測序結果一致。

討論

NS4B通過調控宿主基因表達介導HCV致病性已被多項研究推測，但本研究系統揭示其靶向脂代謝與免疫相關通路的分子機制。CASP3與STAT1的上調提示NS4B可能通過激活凋亡及干擾素信號促進肝細胞損傷，而PPARG的下調或導致脂代謝紊亂，與HCV感染后脂肪變性表型吻合。此外，蛋白質互作網絡中的核心基因（如JUN、MAPK1）為后續功能研究提供了重點方向。

結論

本研究證實HCV NS4B通過調控宿主細胞凋亡、免疫及脂代謝相關基因表達，參與病毒致病過程。篩選的核心基因及通路為開發靶向NS4B的抗病毒策略提供了重要依據。后續研究將聚焦于NS4B與宿主因子的直接互作機制。

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