綿羊誘導多能干細胞電穿孔轉染條件優化研究

摘要

優化綿羊誘導多能干細胞（iPSC）的電穿孔轉染效率。通過系統調整電壓、脈沖時間及質粒濃度，結合威尼德電穿孔儀的參數設置，篩選出轉染效率與細胞存活率的組合。實驗結果顯示，電壓300 V、脈沖時長5 ms、質粒濃度2 μg/μL時，轉染效率達68.2%，細胞存活率>80%。本方案為綿羊iPSC基因編輯研究提供了可靠的技術支持。

引言

綿羊誘導多能干細胞在畜牧育種、疾病模型構建及轉基因動物開發中具有重要應用價值。然而，其轉染效率受限于細胞膜通透性低及傳統轉染方法（如脂質體）的毒性問題。電穿孔技術通過瞬時電脈沖形成膜孔道，可高效遞送外源基因，但參數設置需根據細胞類型精準優化。
本研究針對綿羊iPSC特性，采用威尼德電穿孔儀，探究電壓、脈沖時間及質粒濃度對轉染效率的影響，建立標準化操作流程，以期為后續基因功能研究提供技術基礎。

實驗部分

1. 材料與儀器

細胞來源：綿羊耳緣成纖維細胞重編程獲得的iPSC系，培養于含某試劑（基礎培養基）的體系中。

質粒構建：攜帶綠色熒光蛋白（GFP）及嘌呤霉素抗性基因的pCXLE載體。

核心儀器：威尼德電穿孔儀、威尼德紫外交聯儀、倒置熒光顯微鏡（某品牌）。

2. 實驗方法

2.1 細胞培養與預處理

iPSC以某試劑（含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基）培養，傳代至對數生長期后，用0.25%胰酶消化制備單細胞懸液（密度1×10^6 cells/mL），預冷至4℃備用。

2.2 電穿孔參數設計

采用三因素三水平正交實驗：

電壓梯度：250 V、300 V、350 V

脈沖時間：3 ms、5 ms、7 ms

質粒濃度：1 μg/μL、2 μg/μL、3 μg/μL

每組重復3次，轉染后細胞接種于24孔板，37℃、5% CO?條件下恢復培養24 h。

2.3 轉染效率檢測

熒光顯微鏡觀察：威尼德紫外交聯儀固定細胞后，通過GFP陽性細胞比例計算轉染效率。

流式細胞術：收集細胞懸液，某試劑（PI染色液）標記死細胞，分析存活率。

2.4 數據統計

采用某軟件（SPSS 26.0）進行方差分析，顯著性水平設為P<0.05。

結果與討論

1. 電壓對轉染效率的影響

電壓300 V時，轉染效率達峰值（68.2%±3.1%），顯著高于250 V（45.7%±2.8%）與350 V（52.4%±4.2%）。高電壓（350 V）雖增加膜通透性，但導致細胞存活率下降至62.5%（P<0.01），提示電壓需平衡轉染效率與細胞活性。

2. 脈沖時間與質粒濃度的協同效應

脈沖時間5 ms時，質粒濃度2 μg/μL的組合可顯著提高DNA導入量（熒光強度較1 μg/μL組提升1.8倍），而濃度超過3 μg/μL則引發細胞毒性（存活率<70%）。威尼德電穿孔儀的多脈沖模式（2次間隔100 ms）進一步降低熱損傷風險。

3. 正交實驗優化結果

綜合極差分析表明，電壓為關鍵影響因素（貢獻率42.3%），其次為質粒濃度（31.5%）與脈沖時間（26.2%）。參數組合（300 V、5 ms、2 μg/μL）下，轉染效率與存活率均顯著優于常規方案（P<0.05）。

結論

本研究成功建立了適用于綿羊iPSC的高效電穿孔轉染體系，證實威尼德電穿孔儀可通過參數精細化調控實現基因遞送效率與細胞活性的雙重優化。該方案為綿羊干細胞基因編輯及功能研究提供了重要技術支撐。

技術細節補充

電穿孔緩沖液：采用某試劑（低電導率緩沖液），減少電流熱效應。

質粒純度要求：A260/A280比值1.8-2.0，威尼德分子雜交儀驗證無蛋白殘留。

質量控制：每批次實驗前使用標準質粒進行儀器校準，確保參數穩定性。

參考文獻

1.馬玉珍,王瑞,閆真,等.LipofectamineTM和Fugene-6介導GFP基因轉染綿羊胎兒成纖維細胞的比較研究[J].中國農業科技導報.2008,(1).DOI:10.3969/j.issn.1008-0864.2008.01.019 .

2.王海,陸泉枝,連正興,等.電穿孔導入綠色熒光蛋白基因于綿羊胎兒成纖維細胞研究[J].中國畜牧雜志.2004,(2).DOI:10.3969/j.issn.0258-7033.2004.02.003 .

3.錢鋒,肖成組.影響細胞電穿孔效率的因素[J].生物技術.1998,(5).27-31.

4.Wu,Y.,Guo,Z.,Zhang,Y.,等.Vitamin C enhances nanog expression via activation of the JAK/STAT signaling pathway[J].Stem Cells.2014,32(1).

5.Leonardo, Chicaybam,Andressa Laino, Sodre,Bianca Azevedo, Curzio,等.An efficient low cost method for gene transfer to T lymphocytes.[J].PloS one.2013,8(3).e60298.

6.Weng Z,Pei D,Wolbank S,等.Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells.[J].Cell stem cell.2010,6(1).